工程化人脊髓类器官修复完全横断脊髓损伤：通道图案化支架的关键作用

脊髓损伤(SCI)尤其是完全横断损伤，因胶质瘢痕形成、轴突再生受阻及炎症微环境，临床修复难度极大 —— 现有干细胞移植或支架治疗难以同时满足 “模拟脊髓结构”“支持长期细胞存活”“引导神经再生” 三大需求。人脊髓类器官(HSCO)虽能模拟脊髓发育特征，但传统培养依赖 Matrigel，存在机械强度低、易坍塌、无法引导定向再生等问题。

基于此背景，来自香港城市大学生物医学工程系、香港中文大学、电子科技大学等机构的团队，在《Biomaterials》上发表题为“Generation of engineered human spinal cord organoid in channel-patterned collagen and transplantation for spinal cord regeneration”的研究，开发出基质胶填充的通道图案化 II 型胶原支架(CPCol II-M) ，将人运动神经祖细胞球状体诱导为 HSCO-CPCol II-M，该类器官不仅能长期存活并表达脊髓成熟神经元标志物，移植到裸鼠完全横断 SCI 模型后，还能显著促进运动功能恢复、减少胶质瘢痕、引导轴突再生并调节免疫微环境，为 SCI 修复提供新策略。

实验方法

1.CPCol II-M 支架制备：先制备 II 型胶原支架，用手术打孔器制作贯穿通道(体外直径 3mm、体内 1.5mm)，将支架浸泡于液态 Matrigel 中 4℃静置 24h 使其饱和，37℃孵育凝胶化，形成含通道的 II 型胶原 - Matrigel 复合支架。

2.HSCO-CPCol II-M 生成：hiPSC 来源的人运动神经祖细胞用 Accutase 消化，离心后接种于超低吸附 96 孔板形成球状体;将球状体转移至 CPCol II-M 通道中心，37℃聚合 30min 后，在摇床(60rpm)上用脊髓类器官培养基长期培养，形成 HSCO-CPCol II-M。

3.支架与类器官表征：用扫描电镜(SEM)观察支架微观形态，通过乙醇浸泡法测孔隙率，流变仪和 Instron 测试仪分别测储存模量和压缩模量;免疫荧光染色检测神经元(TUJ1、NeuN)、星形胶质细胞(GFAP)、运动神经元(ChAT、ISL1)等标志物;单细胞 RNA 测序和蛋白质组学分析类器官细胞组成与蛋白表达。

4.裸鼠 SCI 模型构建与移植：麻醉后暴露 T10 脊髓，完全横断后移植 HSCO-CPCol II-M(对照组为空白、Matrigel、CPCol II-M)，术后每日人工排尿至自主排尿恢复;8 周后取材，通过 BMS 评分评估后肢运动功能，MRI 观察脊髓连续性，H&E 染色和免疫荧光检测组织修复情况。

5.安全性评估：取移植后小鼠心、肝、脾、肺、肾做 H&E 染色，检测器官病理变化;采集血液检测肝肾功能指标(如 ALT、AST、尿素、肌酐)，评估全身毒性。

关键结果

图1：HSCO-CPCol II-M 培养与 SCI 移植流程示意图

该图清晰呈现研究核心流程：A 部分展示类器官构建步骤 ——(I)培养人运动神经祖细胞，(II)祖细胞自聚集形成球状体，(III)将球状体嵌入 CPCol II-M 通道，(IV)培养 14-30 天形成成熟 HSCO-CPCol II-M，可长期培养至 180 天;B 部分为移植流程 —— 将 HSCO-CPCol II-M 移植到裸鼠完全横断 SCI 的损伤部位，通过支架通道引导神经再生。整个流程突出 “支架引导类器官定向分化” 与 “移植修复 SCI” 的逻辑链，为后续实验提供清晰框架。

图2：CPCol II-M 支架的形态与力学特征

该图通过多维度验证支架性能：A 为 SEM 图像，显示 Matrigel 致密少孔，CPCol II 呈疏松网状结构，CPCol II-M 保留网状结构且通道内填充 Matrigel;B 为实物图，CPCol II 呈白色海绵状，CPCol II-M 因 Matrigel 填充呈半透明;C 为 Masson 染色，可见胶原纤维在支架中均匀分布;D-F 显示，CPCol II-M 孔隙率(89.47%)显著高于 CPCol II(64.51%)，储存模量(10.33-21.81kPa)和压缩模量(13.38kPa)均优于 CPCol II，证实 Matrigel 与 II 型胶原结合后，既提升孔隙率利于营养交换，又增强力学强度满足移植需求。

图3：HSCO-CPCol II-M 的生成与早期分化特征

该图追踪类器官从球状体到成熟的过程：A 为时间序列图，显示第 0 天祖细胞悬浮、第 1 天形成球状体、第 14 天嵌入支架后扩展、第 30-180 天形成成熟类器官;B-D 为第 30 天免疫荧光，HSCO-CPCol II-M 的神经元标志物 TUJ1 阳性面积(13.10%)显著高于 Matrigel 单独培养组(Spheroid-M，4.99%)，星形胶质细胞标志物 GFAP 阳性面积(3.32%)显著低于 Spheroid-M(12.3%);E-G 为第 90 天染色，HSCO-CPCol II-M 的运动神经元标志物 ChAT(5.12%)和轴突标志物 NF200(10.20%)表达均显著高于 Spheroid-M，证实 CPCol II-M 支架更利于神经分化而非胶质细胞过度增殖。

图4：HSCO-CPCol II-M 的脊髓运动神经元特征

该图验证类器官的脊髓特异性：A 为第 90 天染色，FOXA2(中脑 / 后脑标志物)在两组均不表达，OLIG2(腹侧祖细胞标志物)在两组均有表达(无显著差异)，证明类器官定向分化为脊髓而非其他脑区;B-D 显示，HSCO-CPCol II-M 中 “ISL1+FoxP1+” 侧方运动神经元(支配肢体肌肉)比例显著高于 Spheroid-M;E-F 显示，“ISL1+HB9+” 腹外侧运动神经元(脊髓特有)比例在 HSCO-CPCol II-M 中达 26.50%(HB9+)和 74.00%(ISL1+)，远高于 Spheroid-M 的 2.03% 和 38.10%，证实支架能诱导类器官形成脊髓特异性运动神经元。

图5：HSCO-CPCol II-M 的长期成熟特征(第 180 天)

该图评估类器官长期培养后的成熟度：A-C 显示，HSCO-CPCol II-M 的 TUJ1 阳性面积(显著高于 Spheroid-M)和 GFAP 阳性面积(显著低于 Spheroid-M)的差异持续存在，说明支架支持长期神经分化;D-I 为成熟标志物染色，HSCO-CPCol II-M 的神经元核标志物 NeuN、轴突标志物 NF200、突触可塑性标志物 MAP2、轴突再生标志物 GAP43 及神经递质 5-HT 的表达均显著高于 Spheroid-M;同时 TUNEL 染色显示，Spheroid-M 核心存在大量凋亡，而 HSCO-CPCol II-M 凋亡显著减少，证实支架通道改善营养交换，减少细胞死亡。

图6：HSCO-CPCol II-M 的单细胞 RNA 测序分析

该图解析类器官的细胞组成与功能：A 为 t-SNE 聚类，将 18452 个细胞分为祖细胞、星形胶质细胞、未成熟神经元、脊髓神经元 4 类;B 为标志物表达图，TOP2A(祖细胞)、S100B(星形胶质细胞)、DCX(神经母细胞)、MAP2(成熟神经元)、STMN2(脊髓神经元)在对应聚类中特异性表达;C 为热图，进一步验证各类细胞的特征基因差异;D-E 为 GO 和 KEGG 富集，脊髓神经元聚类显著富集 “轴突结构”“突触组织”“血清素能突触”“谷氨酸能突触” 等通路，从转录组层面证实类器官具备脊髓神经元的功能特征。

图7：HSCO-CPCol II-M 的蛋白质组学分析

该图从蛋白层面验证类器官成熟：A 为韦恩图，HSCO-CPCol II-M 与 CPCol II-M 共鉴定 740 个蛋白，HSCO-CPCol II-M 特有 842 个蛋白;B-C 显示，共筛选出 35 个差异蛋白(22 个上调、13 个下调)，上调蛋白包括轴突生长相关的二氢嘧啶酶相关蛋白 2/3;D 为 GO 注释，差异蛋白主要参与 “细胞过程”“代谢过程”，分子功能以 “结合” 和 “催化活性” 为主，体现活跃的细胞功能;E-F 为 KEGG 富集，上调通路包括 “轴突导向”“运动蛋白相关通路”，下调通路为 “蛋白质消化吸收”，证实类器官在蛋白层面具备神经再生相关功能。

图8：HSCO-CPCol II-M 移植后的 SCI 功能恢复与安全性

该图评估移植后的体内效果：A 为手术流程，显示暴露、分离、横断脊髓并移植支架;B 为 BMS 评分，术后 56 天 HSCO-CPCol II-M 组评分显著高于损伤组，证明运动功能恢复;C 为体重变化，HSCO-CPCol II-M 组体重下降幅度小于损伤组，提示生存状态改善;D 为后肢肌肉重量比，HSCO-CPCol II-M 组(后肢重量 / 体重)显著高于损伤组，减少肌肉萎缩;E 为 MRI，损伤组和 Matrigel 组脊髓持续断裂，HSCO-CPCol II-M 组损伤部位信号连续，提示神经再生;F 为血液生化，各组肝肾功能指标无显著差异，H&E 染色显示心肝肾无病理异常，证实移植安全性。

图9：HSCO-CPCol II-M 移植后的内源性修复机制

该图解析移植后的组织与免疫调节：A 为 GFAP 染色，损伤组形成致密胶质瘢痕，HSCO-CPCol II-M 组 GFAP 阳性细胞减少且沿支架通道纵向排列，为轴突再生提供通道;B-D 显示，HSCO-CPCol II-M 组的轴突标志物 NF200、再生标志物 GAP43 及突触标志物 SYP 在损伤区广泛分布，证实轴突再生与突触重建;E-G 为巨噬细胞染色，HSCO-CPCol II-M 组的总巨噬细胞标志物 CD68 阳性率(8.90%)显著低于损伤组(20.82%)，抗炎 M2 巨噬细胞标志物 CD206 阳性率(5.53%)显著高于损伤组(1.72%)，说明类器官可抑制过度炎症并促进抗炎微环境形成。

全文总结

本研究开发了基质胶填充的通道图案化 II 型胶原支架(CPCol II-M)，成功将人运动神经祖细胞诱导为具有脊髓特异性的 HSCO-CPCol II-M 类器官 —— 该支架通过 “高孔隙率 + 增强力学” 支持类器官长期存活(达 180 天)，并定向诱导其分化为脊髓运动神经元(表达 ChAT、ISL1 等标志物)，同时抑制星形胶质细胞过度增殖;移植到裸鼠完全横断 SCI 模型后，HSCO-CPCol II-M 能通过 “引导胶质细胞纵向排列减少瘢痕”“促进轴突再生与突触重建”“调节巨噬细胞向 M2 型极化减轻炎症” 三大机制，显著改善后肢运动功能、减少肌肉萎缩，且无全身毒性。该研究不仅解决了传统类器官培养的力学与定向分化问题，还为 SCI 的再生治疗提供了 “支架 - 类器官” 一体化的新方案，为后续临床转化奠定基础。