外泌体绿色荧光标记试剂盒（PKH67）

产品描述

PKH67 是一种具有绿色荧光的荧光细胞连接染料。 PKH67(Ex/Em = 490/502 nm)主要用于对外泌体(Exosome)进行体外荧光标记示踪，细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及长期的体内外细胞示踪研究，PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。

适用范围

本说明书适用于PKH67外泌体或细胞标记等相关信息，请严格参照说明书操作。

运输和存储条件

(1)运输条件：冰袋运输，国内现货 2~3 天即可送达。

(2)储存条件：4℃储存。

产品组成信息

表1. 试剂盒组成信息

操作流程

一、染料工作液制备

用Diluent C将PKH67 储存液配制成浓度为 100 μM 的染料工作液(储存浓度为1mM，DMSO配置，工作液应根据实验用量适当配置，现配现用，避光操作)。

二、外泌体染色

1、在外泌体中加入染料工作液，建议染料终浓度为2-5μM (可在 2~20μM 范围调节)。

2、加入染料工作液后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀 1 min，再避光静置孵育 10 min。

3、向孵育后的外泌体染料复合物中加入适量 1×PBS 混匀。

4、转移至10 kDa MWCO(截留分子量)的过滤柱中，在高速离心机中以3000 g离心10分钟，然后根据需要进行1-2次洗滤，彻底去除未结合染料，最后将体积减少至50~100µL。

5、从超滤柱中回收浓缩液，将其保存在微量离心管中并至于冰上，尽快使用标记的外泌体，以确保最高的荧光强度。

三、细胞摄取

1、将PKH67标记外泌体(约20µg/孔)加入至细胞培养孔中，在37℃孵育(4~8h)，结束后，吸除上清，用PBS洗涤2次，后续正常制片做荧光拍照或共聚焦成像。

注意事项

(1)体外追踪实验：PKH67(激发/发射波长 490/502 nm)适合短时(<72小时)观察，但可能干扰膜流动性。体内长时追踪：选择近红外染料(如DiR，激发/发射 750/780 nm)，穿透力强且背景低。

(2)由于外泌体染色效率难以达到100%和在去游离染料过程中无法避免外泌体的损失，建议制备2倍于活体成像或示踪实验所需外泌体量以进行染料标记。

(3)染料工作液应现配现用，不能提前配制，否则将影响染色效果。

(4)仅用于科学研究。

常见问题

(1)标记效率低

现象：流式检测信号弱或荧光显微镜下外泌体无荧光。

可能原因：染料浓度不足或孵育时间过短。

解决方案：建议用于染料标记的外泌体原始浓度大于0.5~1.5 μg/μL，或梯度测试染料浓度(如1 μM、2 μM、5 μM)。

(2)高背景噪音

现象：流式细胞术或荧光成像中出现大量非特异性信号。

可能原因：游离染料未彻底去除。

解决方案：增加超速离心次数(如3次)，延长超滤离心时间或PBS多洗几次。

(3)外泌体聚集或破裂

现象：电镜下外泌体聚集成团或膜结构不完整。

可能原因：染料浓度过高或孵育时间过长。离心速度过高(如>120,000×g)。

解决方案：降低染料浓度至2 μM以下，缩短孵育时间至10分钟。使用蔗糖垫(如30%蔗糖层)保护外泌体结构。

(4)荧光淬灭

现象：标记后荧光信号随时间迅速减弱。

可能原因：样本反复冻融或长期暴露于光照。

解决方案：注意避光操作。分装标记后外泌体，避光-80℃保存。