外泌体提取试剂盒（牛奶）

产品描述

外泌体是细胞分泌的含有 RNA 和蛋白质的囊泡 (30-200 nm)，在体液中大量存在，包括血液、唾液、尿液和母乳等。外泌体在细胞间充当信使，运送货物特异性使其具有不同的功能。然而，外泌体的形成、货物的分选方式以及它们参与的生物途径仍未完全研究清楚。外泌体研究需要分离得到完整的外泌体，当前超速离心是分离的金标准，但这需要昂贵的设备。

本试剂盒提供了一种分离纯化牛奶外泌体的简单可靠的方法。通过促进不易溶解的组分(即外泌体)从溶液中沉淀，操作简单，结果重复性好，杂蛋白含量少，只需普通离心机就可以分离得到较纯的完整外泌体，可用于电镜粒径分析，RNA和蛋白分析，以及细胞和动物实验等。

适用范围

本说明书适用于从牛奶中纯化外泌体，请严格参照说明书操作。本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途!

运输和存储条件

(1)运输条件：常温运输，国内现货 2~3 天即可送达。

(2)储存条件：常温储存。

产品组成信息

表1. 试剂盒组成信息

自备材料

冷冻高速离心机，2 mL 离心管，1×PBS 缓冲液(无菌)。

操作流程

样品预处理：

1、如果是冻存于-80℃样品，取出于4℃或冰上溶化，如果是新鲜样品，收集后置于冰上，建议单次提取时的样品量不低于 20 mL。

2、将生牛奶在 4℃下以 2000g 离心 5 min(注：离心后样品分为三层，上层为脂质层，下层为蛋白沉淀，中间层为乳清。离心后上层状态为“致密、稳定、不易脱落”，若上层“松软、易脱落”且下层沉淀较多，可重复此步骤，每次离心取中间层液体)，以去除乳脂球和细胞，得乳清。

3、按体积比例为10:1加入Solution A1 2mL至乳清中，混匀，从而得到黄色澄清液体，然后加入Solution B 2.5 mL，将混合液被缓慢颠倒混匀后，直至固液分离并且液体部分为“透明状”。

4、4℃下以10000g离心10min，取上清液转移至新离心管中，加入2.5 mL Solution C后颠倒混匀(注：Solution C和 Solution B加入剂量保持一致)。

5、(可选)如果有0.22µm过滤装置，可进行过滤以进一步去除大囊泡。

外泌体提取：

1、在处理后的离心上清液中按4：1加入Exosome Concentration Solution(ECS)，如20 mL上清液加入5 mL的ECS。(注：使用前上下颠倒5-6次混匀)

2、通过涡旋震荡器混匀1min或上下倒置10-12次，直到溶液均匀。

3、将样品在4℃孵育8h以上(注：增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过 24 h)。

4、孵育后，将样品以在4℃以10000g离心60min，移液吸出上清液并丢弃，倒置离心管晾干2min。(注：如果使用的是定角转子，沉淀分布在离心管外侧整个侧面)。

5、将试管以 10000g 离心2min，弃去上清，至无任何残留液体。

6、取适量1×PBS 重悬外泌体(建议每 500 μL用 50~100 μL 左右 1×PBS 重悬)。

7、将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter(EPF 柱)上室中，于 4℃以 3000 g离心 10 min，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒(注：EPF柱不可重复使用)。

8、纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于-80℃低温冰箱中，以备后续实验使用。

注意事项

(1)使用前请仔细阅读说明书，建议严格参照本说明书进行纯化外泌体操作。若需技术支持，欢迎随时致电。

(2)操作过程中需使用无菌器材和试剂，避免外泌体样本被污染。

(3)市售巴氏杀菌奶外泌体含量可能降低，建议使用生乳或低温处理乳。

(4)牛奶中蛋白酶活性高，预处理时需加入蛋白酶抑制剂(如1mM PMSF)。

(5)孵育和离心步骤需在4℃下进行，以保持外泌体的稳定性。

(6)提取的外泌体可重悬于PBS中，分装后于-80℃保存，避免反复冻融。

常见问题

(1)提取的外泌体如何保存?

短时间内使用，可在 2~8℃短暂保存1~2天，若长时间保存，建议放在-80℃冰箱中，避免反复冻融。此外，可使用商业化的外泌体储存试剂，进一步保护外泌体。

(2)重悬的外泌体颗粒不能通过或部分通过纯化柱，如何处理?

当提取的外泌体含有较多的污染蛋白质，离心经过纯化柱时可能会堵塞滤膜，因此，重悬时需要多次吹打，彻底溶解沉淀，然后在经过纯化柱纯化。

(3)如何鉴定提取的外泌体?

一般确定外泌体一般需要三个条件：电镜形态观察，颗粒粒径测定和蛋白标志物检测(Western Blot 检测CD9、CD63以及CD81任意两个表达阳性;Alix、Tsg101任意一个表达阳性;Calnexin、histone 3以及GM130任意一个表达阴性)。