外泌体提取试剂盒（培养细胞上清、尿液或其他体液）

产品描述

外泌体是细胞分泌的含有 RNA 和蛋白质的囊泡 (30~200 nm)，在体液中大量存在，包括血液、唾液、尿液和母乳等。外泌体在细胞间充当信使，运送货物特异性使其具有不同的功能。然而，外泌体的形成、货物的分选方式以及它们参与的生物途径仍未完全研究清楚。外泌体研究需要分离得到完整的外泌体，当前超速离心是分离的金标准，但这需要昂贵的设备。

本试剂盒提供了一种分离纯化培养细胞上清、尿液或其他体液的外泌体的简单可靠的方法。通过促进不易溶解的组分(即外泌体)从溶液中沉淀，操作简单，结果重复性好，杂蛋白含量少，只需普通离心机就可以分离得到较纯的完整外泌体，可用于电镜粒径分析，RNA和蛋白分析，以及细胞和动物实验等。

适用范围

本说明书适用于从细胞上清、尿液或其他体液中纯化外泌体，请严格参照说明书操作。本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途!

运输和存储条件

(1)运输条件：常温运输，国内现货 2~3 天即可送达。

(2)储存条件：常温储存。

产品组成信息

表1. 试剂盒组成信息

自备材料

冷冻高速离心机，50 mL 离心管，1.5 mL 离心管，1×PBS 缓冲液(无菌)。

操作流程

样品预处理：

1、如果是冻存于-80℃样品，取出于4℃或冰上溶化，如果是新鲜样品，收集后置于冰上，建议单次提取时的样品量不低于 20 mL。

2、在4℃ 3000g离心30min去除细胞碎片或死细胞，若沉淀较多，重复该步骤一次。

3、将离心上清液转移至新的离心管中，于 4℃以 10000g离心 30 min，以去除样品中的大囊泡，处理后的上清液转移到新离心管中。

4、(可选)如果有0.22µm过滤装置，可进行过滤处理以进一步去除如凋亡小体等大囊泡。

外泌体提取：

1、加 Exosome Concentration Solution(ECS)：在处理后的离心上清液中按4：1加入 ECS，如20mL上清液加入5 mL的ECS。(注：使用前上下颠倒5-6次混匀。)

2、通过涡旋震荡器混匀1min或上下倒置10-12次，直到溶液均匀。

3、将样品在4℃孵育8h以上(增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过 24 h)。

4、孵育后，将样品在4℃以 10000g 离心 60min，移液吸出上清液并丢弃，尽量去除液体。(注：如果使用的是定角转子，沉淀分布在离心管外侧整个侧面)。

5、将试管在4℃以 10000g 离心2min，弃去上清，至无任何残留液体。

6、取适量1×PBS 重悬外泌体(建议每 20 mL 上清用 100~200 μL 左右 1×PBS 重悬)。

7、将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter(EPF 柱)上室中，于 4℃以 3000 g离心 10 min(可适当延长离心时间)，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒(注：EPF柱不可重复使用)。

8、纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于-80℃低温冰箱中，以备后续实验使用。

注意事项

(1)使用前请仔细阅读说明书，建议严格参照本说明书进行纯化外泌体操作。若需技术支持，欢迎随时致电。

(2)操作过程中需使用无菌器材和试剂，避免外泌体样本被污染。

(3)孵育和离心步骤需在4℃下进行，以保持外泌体的稳定性。

(4)提取的外泌体可重悬于PBS中，分装后于-80℃保存，避免反复冻融。

常见问题

(1)细胞培养时，如何去除培养基中牛血清来源的外泌体?

多数情况下，体外细胞培养时培养基中需要添加牛来源血清，但血清中含有大量外泌体，会污染细胞分泌的外泌体，影响外泌体后续实验，可以采取以下三种方法操作：当细胞长到近乎单层，换成无血清培养基，在 24~48 h后收集细胞培养上清;将血清以100000g 超速离心10h 以上去除血清外泌体，或者购买商业化的去除外泌体的血清;还可查询有无化学成分确定的，无血清培养基进行替换。

(2)提取的外泌体如何保存?

短时间内使用，可在 2~8℃短暂保存1~2天，若长时间保存，建议放在-80℃冰箱中，避免反复冻融。此外，可使用商业化的外泌体储存试剂，进一步保护外泌体。

(3)重悬的外泌体颗粒不能通过或部分通过纯化柱，如何处理?

当提取的外泌体含有较多的污染蛋白质，离心经过纯化柱时可能会堵塞滤膜，因此，重悬时需要多次吹打，彻底溶解沉淀，然后在经过纯化柱纯化。

(4)如何鉴定提取的外泌体?

一般确定外泌体一般需要三个条件：电镜形态观察，颗粒粒径测定和蛋白标志物检测(Western Blot 检测CD9、CD63以及CD81任意两个表达阳性;Alix、Tsg101任意一个表达阳性;Calnexin、histone 3以及GM130任意一个表达阴性)。