外泌体荧光染料（DiR）

产品描述

DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染料是一族亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，这类染料有着很高的淬灭常数和激发态寿命。一旦对细胞染色，这类染料在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。它们的荧光颜色区分明显：DiI(橙色荧光)，DiO(绿色荧光)，DiD(红色荧光)和 DiR (深红色荧光)这使得他们可以用来对活细胞进行多色成像和流式分析。DiR(ex/em = 748/780 nm)在活体成像或者示踪中非常有用，因为它们所发射的红外光可以高效地穿过细胞和组织，并且在红外光范围内，其本底荧光水平很低。

适用范围

本说明书适用于DiR外泌体或细胞标记等相关信息，请严格参照说明书操作。

运输和存储条件

(1)运输条件：冰袋运输，国内现货 2~3 天即可送达。

(2)储存条件：-20℃避光储存。

产品组成信息

表1. 试剂盒组成信息

 操作流程

一、染料工作液制备

用合适的缓冲液(如：无血清培养基，HBSS或PBS)稀释储存液，配制浓度为1～5 µM的工作液。

注意：工作液的最终浓度是根据不同细胞和实验的经验来配制。可以从推荐浓度的十倍以上寻找最佳条件，此外，未使用的储存液保存在-20 ℃，避免反复冻融。

二、外泌体染色

1、在外泌体(建议浓度≥1×10^10 particles/mL)悬液中加入染料工作液，建议染料终浓度为1~5 μM(需预实验确定，避免过量导致毒性)。

2、加入染料工作液后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀1 min，再放置于37℃孵育30 min(避免高温破坏外泌体膜)。

3、向孵育后的外泌体染料复合物中加入适量 1×PBS 混匀，超过0.5mL时分批次进行离心。

4、转移至100 kDa MWCO(截留分子量)的过滤柱中，在高速离心机中以3000 g离心10分钟，PBS洗涤2次，彻底去除未结合的染料，最后将体积减少至50~100µL。

5、从超滤柱中回收浓缩液，将其保存在微量离心管中并至于冰上，尽快使用标记的外泌体，以确保最高的荧光强度。

三、体内示踪

将100 μL DiR标记的外泌体(约10^10 particles)通过尾静脉注射(全身分布研究)或局部注射小鼠，在不同时间点(如0、1、2、4、6、24小时)拍摄荧光图像，成像结束后，处死小鼠并取出主要器官(如肝、脾、肺、肾、心)，对器官进行离体荧光成像，分析外泌体的分布。

注意事项

(1)体外追踪实验：PKH 26(激发/发射波长 551/567 nm)适合短时(<72小时)观察，但可能干扰膜流动性。体内长时追踪：选择近红外染料(如DiR，激发/发射 750/780 nm)，穿透力强且背景低。

(2)由于外泌体染色效率难以达到100%和在去游离染料过程中无法避免外泌体的损失，建议制备2倍于活体成像或示踪实验所需外泌体量以进行染料标记。

(3)染料工作液应现配现用，不能提前配制，否则将影响染色效果。

(4)仅用于科学研究。

常见问题

(1)标记效率低

现象：流式检测信号弱或荧光显微镜下外泌体无荧光。

可能原因：染料浓度不足或孵育时间过短。

解决方案：建议用于染料标记的外泌体原始浓度大于0.5~1.5 μg/μL，或梯度测试染料浓度(如1 μM、2 μM、5 μM)。

(2)高背景噪音

现象：流式细胞术或荧光成像中出现大量非特异性信号。

可能原因：游离染料未彻底去除。

解决方案：使用超速离心去除游离染料，延长超滤离心时间或PBS多洗几次。

(3)外泌体聚集或破裂

现象：电镜下外泌体聚集成团或膜结构不完整。

可能原因：染料浓度过高或孵育时间过长。离心速度过高(如>120,000×g)。

解决方案：降低染料浓度至2 μM以下，缩短孵育时间至10分钟。使用蔗糖垫(如30%蔗糖层)保护外泌体结构。

(4)活体成像信号集中于肝脏

现象：肝脏信号过强

可能原因：单核吞噬系统非特异性摄取

解决方案：注射后延长成像时间(如24小时)或使用靶向修饰外泌体(如CD47过表达)。

(5)荧光淬灭

现象：标记后荧光信号随时间迅速减弱。

可能原因：样本反复冻融或长期暴露于光照。

解决方案：注意避光操作。分装标记后外泌体，避光-80℃保存。