​C2C12细胞诱导分化肌管实验流程

C2C12成肌细胞引言

C2C12是由D·Yaffe和O·Saxel建立的小鼠成肌细胞株的亚克隆。C2C12细胞分化很快，容易形成可伸缩的肌管并生成特征性的肌蛋白。用骨形成蛋白2(BMP-2)处理C2C12细胞，会导致C2C12细胞的分化途径从成肌细胞转换为成骨细胞。

C2C12作为研究肌肉理想的细胞模型，在实验研究中常诱导其分化为多核肌管。成肌分化在肌肉再生中起重要作用，它是通过一种高度协调的序列程序来产生成熟的骨骼肌的过程。

C2C12成肌细胞是一种常见的细胞模型，用于研究肌肉生长和发育的过程。这种细胞在适当的条件下，可以被诱导分化为肌管，模拟肌肉组织的形成。本实验旨在探讨C2C12成肌细胞在体外诱导分化为肌管的最佳条件和过程。

C2C12细胞成肌注意事项

细胞状态直接影响着分化潜力，要想C2C12细胞分化做得好，首以下三点，需要留意

1.c2c12细胞生长速度快，容易分化，建议密度达70%时传代;

2.不要让细胞长得太满甚至开始融合，影响后续成肌分化率;

3.c2c12细胞消化完全后再吹打混匀，不要用枪头把没有消化好的细胞吹下来，以免细胞成团。

C2C12细胞诱导成肌实验原理

成肌细胞分化的研究对理解肌肉细胞发育和修复(再生)是非常重要的。

低浓度的马血清能够有效刺激C2C12成肌细胞向成熟细胞分化。

c2c12细胞培养条件

DMEM高糖+10%FBS+1%双抗

c2c12细胞成肌实验需要具备哪些条件

诱导培养基：DMEM+2%马血清(注意：马血清的质量严重影响分化的分化，建议做复孔和不同马血清梯度浓度)

1.传代密度： 维持细胞浓度在1.5~10×105 viable cells/75 cm2;2~3天换液1次。

2.细胞代数：建议传代 C5 内开始实验

3.分化诱导密度：70-80% 传代或加入分化培养基。(注意：实验统计：细胞融合到100%，会严重影响成管细胞的形成)

4.设置复孔：刚开始进行实验时，建议设立诱导 4天、6天、8天、10天、12天 这几个时间点观察，每天显微镜观察细胞形态， 拍照存图。一般8-9天达到高峰。约有40%分化成熟的肌管，往后细胞逐渐衰老凋亡(注意：每天换液时需预热分化培养基，并轻柔沿壁加入，避免冲起细胞。)

5.尽可能在皿里培养，且使用明胶在进行包被，减少诱导过程中细胞漂浮的情况。

C2C12细胞诱导分化肌管实验流程

待c2c12细胞生长至汇合度为80%左右时，即可进行诱导分化。具体步骤如下:

1.丢弃旧培养基，用PBS清洗两次；

2.换分化培养基(高糖DMEM+2%马血清+1% P/S)诱导，然后置于CO2恒温培养箱中进行培养；

3.每24h换液一次，在显微镜下观察细胞形态和生长状况。诱导分化成功时，可以看见肌管表现为厚的管状结构，有时为多核。

4.在诱导分化的过程中，通过显微镜观察细胞的形态变化，并分别在0h、24h、48h、72h收集细胞样本，用Western blot检测肌肉特异性蛋白质的表达水平。

C2C12细胞成肌小贴士

c2c12细胞代数不要太高；

若加入分化培养基后，细胞仍然继续生长，可用吉姆萨染色验证是否有分化了的肌纤维；

成肌分化过程中会有少量细胞凋亡，属于正常现象。

C2C12细胞分化成功指标

1. 可通过吉姆萨Gimsa染色并显微镜下观察

2. 细胞免疫化学检测细胞肌性蛋白分子表达

3. 使用RT-PCR检测细胞肌性mRNA分子表达，结蛋白desmin、成肌分化抗原myod、生肌素myogenin、肌球蛋白mysin等在分化过程中表达逐渐增强。

C2C12细胞结果与分析

1.细胞形态变化

在诱导分化培养基的作用下，C2C12成肌细胞的形态逐渐发生变化，由原来的扁平形态逐渐变为梭形或圆形，这是肌管形成的典型形态学特征。

2.肌肉特异性蛋白质的表达水平通过Western blot检测发现，随着诱导分化的时间延长，肌肉特异性蛋白质的表达水平逐渐升高。这表明C2C12成肌细胞在诱导分化培养基的作用下，逐渐分化为具有肌肉特性的细胞。

C2C12细胞讨论与结论

本实验通过使用诱导分化培养基，成功地使C2C12成肌细胞在体外分化为肌管。结果表明，该细胞系在适当的条件下具有分化为肌肉组织的潜能。这对于研究肌肉生长和发育的机制具有重要意义，同时也为未来的再生医学研究提供了新的思路。

C2C12细胞成肌参考文献

[1]张琳. EPA和DHA对C2C12成肌细胞增殖,分化和凋亡的影响[D]. 武汉轻工大学, 2018.