细胞培养板污染和分布不均解决方法

如何解决细胞培养板污染，首先细胞培养板在进行细胞操作时需遵循严格无菌的原则，各项操作要保证规范、科学，不对细胞的生长造成额外的影响。那么如何保证加样后细胞的均匀和尽量减少换液对细胞生长状态的影响。

细胞培养板污染问题及解决办法

问题1：96，24孔培养板或培养皿的盖子都很松，这样是方便了透气，但是细菌、霉菌等污染物会不会也随着溜进去呢?

答：1.盖子很松，属于半开放培养，这样的目的是透气(实际上是为了使培养皿外的co2能够与培养皿充分交换，维持培养基的pH值)。

2.凡事有利必有弊，这样当然增加了污染的可能性。此外这样还会使培养皿内的液体蒸发，这对于精确定量的药物来说就显得值得注意了。所以以下二条措施是必须的a培养箱内空气必须清洁(定期紫外线照，酒精擦洗，尽量少开关培养箱)b培养箱内的湿度必须始终保持为100%(培养箱内放置无菌蒸馏水的水槽)。

就好像培养皿，也是一个盖倒扣的容器，也不会污染。主要是因为盖子“L”型边缘产生气流负压的缘故，灰尘上面才附着有微生物，而气流携带的灰尘是无法通过产生负压的盖边缘的。而透气作用只是通过空气的扩散，不会产生气流，所以只会透气不会透菌。

问题2：使用24孔板，在其中的某些孔中有操作(在超净台内)，而其他孔中还有细胞要培养，我很担心这样会污染，不知道要注意什么?

答：在超净台内如果操作规范的话应该可以的，可以充分利用培养版的盖子，尽量只暴露要操作的孔，将其他孔用盖子盖起来。

使用前综合考虑一下，充分使用所以的孔;如果只需要使用少数的孔可以只用一边的，其余用盖子盖住。

其实自己感觉只要注意无菌操作，一般是不会污染的。操作时用几块玻片把板子一侧垫高，不要把盖子全打开，一般没问题。

细胞分布不均及解决办法

问题1：细胞接种培养板，细胞总是聚集在周边部分，该如何处理

答：请问你的细胞是如何混匀的?是滴管吹打还是振荡培养板?如果是后者，而且是转圈摇匀的话，很有可能由于离心力的作用使细胞甩到周边部分，导致细胞中间少，四周多!

这里提供一个好办法：在培养种板之前，把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和后再取出，种入细胞时力量要轻，可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让细胞悬液流入板孔中，培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振荡，否则你的细胞就会想你说得那样聚积在一起。

培养板孔直径愈小，这个现象越明显，24、96孔板这种现象不可避免，因为液体的附壁使得孔内培养液不是成一个液平面，而是周边高，就像凹镜一样，而使用这两种孔板由于需要加干预等原因而不能加足量培养液，使得细胞随培养液一起出现“边集”现象，如果为了使孔中央也有均匀细胞而增加接种细胞数量的话，这要看你需要观察何种指标，如果是MTT，免疫组化的话会因为细胞成层而影响结果。

消化细胞时要注意吹打均匀，避免细胞成团，而且孔内培养液量要足够，一般接种时加足量培养液，加干预时换一次液，干预液加培养液量等于接种时培养液量，这样的话“边集”现象会有所改观，不妨一试。

问题2：我做的是空斑形成实验，最好是细胞铺成均匀的一层，，可接种病毒时大部分孔都还好，个别的不太均匀。细胞组内差异很大，想请教一下大家加细胞的时候都有什么方法?

答：细胞消化后吹打成单细胞悬液很关键!保证分板时每个孔的细胞数目是一致的!

当然还有处理因素各个孔之间的平行也很重要，比如说加药时，药物稀释后混匀，保证每个孔的浓度是一致的!

再者加细胞和药物时，要试验组和对照组一块轮流加，避免加样先后顺序导致细胞密度和药物浓度的差异!

问：吹打已经是均匀了，但是铺板，6孔，24孔总有些不均匀，有点往中间集中。而且明明计数好了铺，长一两天，各个孔密度又不一样，对检测有影响，有良策吗?

答：如果用巴氏吸管铺的话，每次吸取的量不要太多，因为吸管内的细胞会自动向下沉，往往第一开始几个孔细胞数多，经常均匀细胞悬液，加液走S型路线。

如果用移液器的话，tips要处理下，把去掉避免损伤细胞，这样每一次取液对应一个孔。用tip一对一孔加入比较准确。但也要注意混匀悬液。

设立平行组，n要足够大(可以计算一下)。

铺板后不要摇，因为摇动会导致细胞向中间聚集。最好铺板一次搞定。

问题3：想请教一下大家加细胞的时候都有什么方法?

我觉得有几点：

1.细胞消化后吹打成单细胞悬液很关键!保证分板时每个孔的细胞数目是一致的!

2.当然还有你的处理因素各个孔之间的平行也很重要，比如说加药时，药物稀释后混匀，保证每个孔的浓度是一致的!

3.再者加细胞和药物时，要试验组和对照组一块轮流加，避免加样先后顺序导致细胞密度和药物浓度的差异。