EdU（5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷）

产品描述

EdU是一种新型胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷，thymidine)类似物，可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中。EdU上的乙炔基能与荧光标记的叠氮化物 (如Azide Alexa Fluor 488、Azide Alexa Fluor 555、Azide Alexa Fluor 594、Azide Alexa Fluor 647等)或者Biotin标记的叠氮化物通过一价铜离子的催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速，被称作点击反应(Click reaction)。然后检测叠氮化物上所标记的相应物质，从而达到检测新合成DNA的目的。现在常用于替代BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)，应用于细胞增殖试剂盒中。

适用范围

EdU 适用于各种动物活体注射，稳定性较好，对活体无明显副作用，可将目标组织制备为石蜡或冰冻组织切片后检测，也适用于体外培养的细胞增殖检测。本产品系列适用于小鼠、大鼠及其他动物模型的各种组织器官(血管除外)的细胞增殖检测。

运输和存储条件

-20 ℃保存与运输，保质期12个月。

产品信息

使用说明

一、动物 EdU 注射造模及组织切片染色

(一)实验前须知

表 1 EdU 注射液配置参考

EdU 建议初始给药量为 5 mg/kg，稀释浓度为0.5~1 mg/mL。

注：1. 可采用 PBS 或生理盐水稀释。

2. 注射时可将 EdU 注射液进一步稀释，不会影响 EdU 的稳定性。

表 2 动物实验 EdU 标记时间及剂量参考

注：另可参考 BrdU 实验的注射时间，EdU 浓度按本说明书建议起始浓度或另行摸索。

(二)EdU 标记

1. 动物 EdU 注射(具体参数可参考表 2)

(1) 注射方式：依据客户实验而定，如腹腔注射、皮下注射、肌肉注射、尾静脉注射等方式，其中以腹腔注射为多。

(2) 标记时间：最佳标记时间依据具体实验目的而定，小肠等增殖快的组织宜采用短时间标记(< 12 h)，大脑等增殖慢的组织器官可能需要长时间标记(如 7 天或更长时间)。

(3) 标记浓度：最佳标记浓度依据具体标记时间而定，5 mg/kg 剂量适合大部分实验。

(4) 取样部位：依据客户实验目的而定，一次标记可以对多种组织和器官切片，由于小肠上皮组织增殖较快，可以作为标记参考。

注：建议任何实验均可取小肠组织检测细胞增殖情况，小肠上皮组织细胞增殖速度快，成年小鼠EdU 注射 6 h 后即可检测到阳性信息，可用作实验阳性对照进行预实验。

(三)切片处理

1. 切片前处理：组织器官最好进行清洗，以去除血液、组织或器官中残留的 EdU，降低背景。

2. 切片厚度：3~10 μm 为宜，切片过厚可能影响切片背景。

3. 切片后处理：

(1) 石蜡切片处理：二甲苯脱蜡 2 次，每次 10 min，乙醇梯度(100%，95%，85%，75%)水合各 1 次，每次 5 min，去离子水清洗 1 次，每次 3 min。

(2) 冰冻切片处理：放置恢复到室温，加入适量丙酮，4℃固定 10 min。去除固定液，用 PBS 清洗 3 次，每次 5 min。注：建议根据实验选择合适的固定剂，若使用甲醛类固定剂进行固定，固定完成需先加入 2 mg/mL 甘氨酸清洗 10 min，中和残留的固定液，再进行 PBS 清洗。

4. 将切片稍甩干，用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)，稍干后在圈内加入适量通透液(0.5% Triton X-100 in PBS)，覆盖样本即可，室温孵育 15 min，去除通透液后用 PBS 清洗 3 次，每次 5 min。

二、EdU检测

使用本产品进行 EdU 标记后，选择IMFP-P002、IMFP-P003、IMFP-P004、IMFP-P005 等 EdU 成像试剂盒进行染色，具体操作步骤参照相关说明书。

1. 对于切片，可以根据切片大小，每个切片使用100-200μl的反应混合物。如下以六孔板中的细胞样品为例说明具体的操作方法，对于其它孔板或切片，仅每步溶液的用量按比例调整即可，其余方法相同。

1.1 配制Click Additive Solution：50T用2.6ml去离子水溶解一管Click Additive，500T用26ml去离子水溶解一瓶Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution。配制后可以适当分装，并-20℃保存。

1.2 参考下表配制Click反应液。注意：请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液，否则点击反应可能无法有效进行;同时，Click反应液须在配制后15分钟内使用。

表 3 Click-iT 反应混合物

1.3 去除上一步骤中的洗涤液。

1.4 每孔加入0.5ml Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。

1.5 室温避光孵育30min。

1.6 吸除Click反应液，用3% BSA in PBS，清洗3次。加入适量甲醇清洗2 次，覆盖样本即可，每次 5 min。去除甲醇，加入适量 PBS 清洗3 次，每次5 min。注：由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景。

1.7 如果需要对细胞核进行染色，可以参照步骤2进行。

2、细胞核染色

为了检测细胞增殖的比例，可以考虑使用Hoechst 33342进行细胞核染色。一般高内涵筛选仪器也需要对细胞核进行染色。

2.1 1X Hoechst 33342溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀释Hoechst 33342 (1000X)。

2.2 接上述步骤，吸除洗涤液后，加入 100μL Hoechst 33342溶液至每个切片，覆盖样本即可，室温避光孵育 20 min(建议根据实际染色情况对染色液浓度及染色时间上下摸索)。

2.4 用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。

三、封片(组织切片)

(一)石蜡切片：去除 PBS，将石蜡切片依次放入 75%乙醇 2 min-85%乙醇 2 min-95%乙醇 2 min-无水乙醇 5 min-无水乙醇 5 min，进行脱水，放入二甲苯中 5 min，进行透明，最后将切片从二甲苯取出，向样本上加入中性树胶进行封片。

(二)冰冻切片：去除 PBS，向样本上加入中性树胶进行封片。

四、成像及分析

表4 荧光发射光谱

注：建议封片完成后立即进行荧光显微镜拍照观察;如果条件限制，可将切片避光置于阴凉干燥处暂存，尽快观察拍照。

注意事项

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 该产品对皮肤有不可逆损伤的可能性，请注意防护，避免吸入性风险。

3. 试剂保存：粉末在-20℃避光保存，1 年有效;配置成溶液，-20℃避光保存，1 个月有效，-80℃避光保存，6 个月有效。

4. 请使用一次性手套，废液请妥善处理。

5. 本产品仅限于科研，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。