AF 594 Click-iT EdU通用款细胞增殖检测试剂盒（红色荧光）

产品描述

AF594 Click-iT EdU通用款细胞增殖检测试剂盒(红色荧光)是一种基于DNA合成过程中胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)类似物EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)的掺入，并通过随后的点击反应(Click reaction)使EdU被AF594所标记，从而实现简单、快速、高灵敏地检测细胞增殖的试剂盒。

经本试剂盒处理后，增殖的细胞在荧光显微镜下呈现非常明亮的红色荧光，可以用于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪检测，也可以用于高内涵筛选(High-Content Screening, HCS)。流式细胞仪或荧光酶标仪检测仅适用于细胞样品，不适用于组织切片。

EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名为5-乙炔基-2'-脱氧尿苷，是一种新型胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷，thymidine)类似物，EdU可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中。另一方面，EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针(如Azide Alexa Fluor 488、Azide Alexa Fluor 555、Azide Alexa Fluor 594、Azide Alexa Fluor 647等)通过一价铜离子的催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速，被称作点击反应(Click reaction)，其反应原理参见图1。通过点击反应，新合成的DNA会被相应的荧光探针所标记，从而可以使用适当的荧光检测设备检测到增殖的细胞。

本试剂盒50T如果用于96孔板检测，可以检测50个样品，每个样品的检测体系为50μl的Click反应液;如果用于培养的细胞(6孔板)的检测，可以检测5个样品，每个样品的反应体系为500μL的Click反应液;如果用于12孔、24孔、48孔或384孔板样品的检测，分别可以检测12.5、25、35和125个样品，每个样品推荐的Click反应液用量为200μL、100μL、70μL和20μL。如果用于流式细胞仪检测，可以检测5个样品，每个细胞样品的细胞数量宜为10-100万，每个样品的反应体系为500μL的Click反应液。如果用于冰冻或石蜡切片的检测，可以检测12.5-25个样品，每个样品的反应体系为100-200μL的Click反应液。500T检测数量为50T的10倍。

图1. AF594 Click-iT EdU检测法中的点击反应(Click reaction)原理图。荧光探针等标记的叠氮化物(Labeled Azide)与掺入到细胞DNA中的EdU，在铜离子的催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，最终使细胞DNA标记上荧光探针或其它探针。

适用范围

本试剂盒可以检测到细胞或组织样品中单个的增殖细胞，同时也可以对细胞或组织样品总体的细胞增殖情况进行定量检测。本试剂盒可以检测培养的细胞或组织样品，也可以检测组织切片。

运输和存储条件

-20 ℃保存与运输，保质期12个月。

试剂盒组成信息

产品优势

1、本试剂盒反应简单、检测灵敏度高。本试剂盒基于简单高效的点击反应，无需DNA变性，只需少量的小分子叠氮化物探针即可非常有效地标记出掺入的EdU，并且可以检测到单个细胞的增殖情况。

2、本试剂盒使用便捷、兼容性好。本试剂盒只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透，就可以使叠氮化物探针有效进入细胞并发生点击反应，不会影响细胞形态，不会影响基于抗体的免疫荧光和免疫组化检测，也不会影响DNA的荧光染色(如PI染色检测细胞周期、DAPI或Hoechst染料检测细胞核)。而BrdU法为了使大分子的BrdU抗体进入细胞并与DNA上的BrdU结合，需要对双链DNA进行变性处理(如酸变性、热变性或者DNase消化等)，这种变性可能会影响细胞形态，影响后续的免疫荧光和免疫组化检测、DNA的荧光染色等。BrdU法和YF®594 Click-iT EdU法检测原理的比较参见图2。

图2.BrdU法和AF 594 Click-iT EdU法检测原理的比较。A.BrdU法需使用大分子的BrdU抗体，由于空间位阻，双链DNA须变性后才能使BrdU抗体与BrdU结合。B.EdU法使用小分子标记的叠氮化物(Azide)，无需DNA变性，操作更便捷，兼容性好，检测结果更加稳定可靠。

3、本试剂盒检测快速，定性定量检测都非常便捷。相对于至少需要4小时的BrdU法，本试剂盒采用的AF594 Click-iT EdU法检测新合成的DNA只需1.5-2小时，时间上大大缩短。本试剂盒同时提供了染色细胞核的Hoechst 33342，以方便染色观察所有的细胞核。可以使用荧光显微镜或流式细胞仪等进行定性和定量检测。

使用说明

1、需要用户自己准备的耗材和试剂

1.1 PBS缓冲液或者DPBS缓冲液。

1.2 固定液(免疫染色固定液或者4%的多聚甲醛)。

1.3 洗涤液(免疫染色封闭液、QuickBlock™免疫染色封闭液、含3% BSA的PBS溶液)。

1.4 通透液(免疫染色强力通透液、免疫染色洗涤液、含0.3% Triton X-100的PBS溶液)。

1.5 去离子水或者超纯水。

1.6 根据实验要求：18×18mm盖玻片，6孔板或其它多孔板，或流式细胞分析仪用管子(如12×75mm)。

2、检测体系的准备

2.1 如下以6孔板或常规切片检测体系为例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，检测体系可以相应按比例缩小。

2.2 如果检测的是悬浮细胞，请按常规的悬浮细胞的操作方式进行。例如和贴壁细胞相比，相关步骤需要增加离心步骤等，如1000×g室温离心5min。

3、培养细胞的EdU标记及固定、洗涤和通透

3.1 在6孔板中(如有必要可以加入盖玻片)培养适当数量的细胞。细胞培养过夜并且恢复到正常状态后，进行所需的药物处理或者其它刺激处理等。

3.2 配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是与培养液等体积加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推荐的EdU终浓度为10μM (1X)，用细胞培养液1:500稀释EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。

【注】：对于A549、HeLa和NIH/3T3等贴壁细胞，推荐EdU的使用终浓度为10μM。但细胞类型、培养液种类、细胞密度、细胞增殖速度等多方面的因素会影响EdU掺入到细胞中的量，因此初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索。如果之前使用过BrdU进行实验，则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。

3.3 将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM)，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1X。例如设计终浓度为10μM，原先6孔板中的培养基为1ml，则将1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培养基体积过大，可以先吸除适量的培养液，再加入等体积的2X的EdU工作液;或者可以减少工作液的体积并增加EdU的浓度，使最终培养液中的EdU浓度为10μM，例如2ml培养液中加入220μL 0.1mM EdU。更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有影响，因此不建议替换所有的培养液。

3.4 继续孵育细胞2小时。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常宜继续孵育细胞周期10%左右的时间。对于常见的哺乳动物细胞如HeLa、3T3、HEK293等，细胞周期大约在18-25小时，孵育时间宜在2小时左右。人胚胎细胞的细胞周期约30分钟，推荐的孵育时间为5分钟;酵母细胞的细胞周期约3小时，推荐的孵育时间为20分钟，增殖的神经细胞其细胞周期约5天，推荐的孵育时间为1天。孵育时间小于45分钟时，建议提高EdU的浓度;孵育时间大于20小时时，建议适当降低EdU的浓度。

3.5 EdU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液或4%的多聚甲醛)，室温固定15分钟。注：对于流式细胞仪检测，贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬后再固定。

3.6 去除固定液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5分钟。

3.7 去除洗涤液，每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色强力通透液，免疫染色洗涤液，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室温孵育10-15分钟。

3.8 去除通透液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5分钟。

3.9 转步骤5。

4、动物体内EdU的标记及切片样品的处理

EdU可以通过注射或进食等适当方式进行动物的体内标记。如下以小鼠为例，其它动物体内EdU的标记请参考相关文献。

4.1 对于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定浓度，腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关，可以参考相关文献，因此初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的浓度进行测试。如果之前使用过BrdU进行实验，则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。

4.2 4小时后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时间也可以参考相关文献自行调整。

4.3 对于冰冻切片：

4.3.1 加入适量固定液(可以使用免疫染色固定液或4%的多聚甲醛)，室温固定15分钟。

4.3.2 去除固定液，用适量洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。

4.3.3 去除洗涤液，用适量通透液(可以使用免疫染色强力通透液，免疫染色洗涤液或含0.3% Triton X-100的PBS)，室温孵育10-15分钟。

4.3.4 去除通透液，用适量洗涤液洗涤1-2次，每次3-5分钟。

4.3.5 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色，并有必要进行抗原修复，可以使用适当的抗原修复液，例如冰冻切片快速抗原修复液(5X)，或者自行配制的适当的抗原修复液进行抗原修复处理。

4.3.6 转步骤5。

4.4 对于石蜡切片：

4.4.1 脱蜡：二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟，换新的无水乙醇3分钟。95%乙醇3分钟。85%乙醇3分钟。75%乙醇3分钟。50%乙醇3分钟。PBS 5分钟。

4.4.2 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色，可以使用适当的抗原修复液，例如柠檬酸钠抗原修复液(50X)、改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X)、EDTA抗原修复液(50X)、柠檬酸钠-EDTA抗原修复液(40X)、通用型强力抗原修复液(10X)、漂片抗原修复液(10X)，或者自行配制适当的抗原修复液进行抗原修复处理。

【注】：如果使用蛋白酶K或胰酶进行抗原修复，必须反复洗涤干净，否则残留的酶会严重干扰后续标记反应。

4.4.3 转步骤5。

5、EdU检测

【注】：本步骤六孔板中每孔的反应体系为500μl的反应混合物。对于12、24、48、96和384孔板，每孔的反应的体系分别为200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反应混合物。对于较小的孔，单位培养面积的液体用量已经适当增加，以有效避免液体蒸发可能带来的负面影响。对于切片，可以根据切片大小，每个切片使用100-200μl的反应混合物。如下以六孔板中的细胞样品为例说明具体的操作方法，对于其它孔板或切片，仅每步溶液的用量按比例调整即可，其余方法相同。

5.1 配制Click Additive Solution：50T用2.6ml去离子水溶解一管Click Additive，500T用26ml去离子水溶解一瓶Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution。配制后可以适当分装，并-20℃保存。

5.2 参考下表配制Click反应液。注意：请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液，否则点击反应可能无法有效进行;同时，Click反应液须在配制后15分钟内使用。

5.3 去除上一步骤中的洗涤液。

5.4 每孔加入0.5ml Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。

5.5 室温避光孵育30min。

5.6 吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。

5.7 如果需要对细胞核进行染色，可以参照步骤6进行。如无其它的特殊需要，即可在荧光显微镜下观察，或者使用流式细胞仪、多功能酶标仪进行荧光检测，或者用高内涵筛选仪器(一般高内涵筛选需要使用染料对细胞核进行染色)进行检测。Azide 594的最大激发波长是590nm，最大发射波长是615nm。

6、细胞核染色

为了检测细胞增殖的比例，可以考虑使用Hoechst 33342进行细胞核染色。一般高内涵筛选仪器也需要对细胞核进行染色。

6.1 1X Hoechst 33342溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀释Hoechst 33342 (1000X)。

6.2 接上述步骤5.6，吸除洗涤液后，每孔加1X Hoechst 33342溶液1ml，室温避光孵育10min。

6.3 吸除1X Hoechst 33342溶液。

6.4 用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。

6.5 随后即可进行荧光检测。Hoechst 33342为蓝色荧光，最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm。

7、流式细胞仪检测

对于经步骤5或6获得的细胞悬液样品进行流式检测。如果使用传统的流体动力学聚焦的流式细胞仪来测量总DNA含量，请在检测过程中使用低流速，实验中的每个样品应使用相同的收集速率和细胞浓度。EdU标记产生的荧光信号一般使用对数刻度的横坐标。Azide 488的最大激发波长是590nm，最大发射波长是615nm。

【注1】：建议使用未经EdU标记的细胞样品作为流式细胞仪检测的阴性对照，并选择合适的电压。

【注2】：由于流式细胞仪检测比较灵敏，可根据细胞类型和实际染色情况对Azide 594的使用量进行适当调整。

注意事项

1、实验前需戴好防护眼镜，穿戴防护服和口罩，佩戴手套，避免与皮肤接触。

2、荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

3、Click Additive配制成溶液后请注意适当分装。如果溶解后有白色物质析出，请上下颠倒多次，待全部溶解后使用。如果该溶液颜色变成棕色，说明该组分的有效成分已失效，请弃用。

4、本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

5、由于本产品需要铜离子催化进行点击反应，请注意如下的兼容性问题及解决方案。本产品完全兼容有机类染料如Alexa Fluor®系列普通染料及fluorescein (FITC)、Allophycocyanin (APC)及APCE-tandems染料;对于Qdot®纳米晶体探针、Horseradish peroxidase (HRP)、R-phycoerythrin (R-PE)和R-PE-tandems染料如Alexa Fluor®680-R-PE等，需要在点击反应完成后进行反应和检测。

6、本产品会影响GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光，对于荧光类蛋白如Green Fluorescent Protein (GFP)、TC-FlAsH™和TC-ReAsH™类试剂，需要在点击反应前进行反应和检测。

7、由于Phalloidin(鬼笔环肽)不兼容点击反应，推荐使用Tubulin-Tracker Red进行细胞微管的检测。