hPSC诱导分化内皮细胞试剂盒

产品描述

本试剂盒专为人诱导多能干细胞(hPSC)高效定向分化为内皮细胞(Endothelial Cells, ECs)而设计，提供标准化、无血清、化学成分明确的培养体系，适用于疾病模型构建、药物筛选及细胞治疗研究，获得的ECs能表达特异性标志物(如 PECAM , VE-Cadherin 等)，并且能够形成血管，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对内皮细胞培养具有一定了解。

以六孔板为例，本产品提供的规格可供10个孔的hPSC诱导分化，最终可获得至少2.5×107细胞量的内皮细胞，以及可供获得的内皮细胞扩增一代。

本产品分化流程图

hPSC：人多能干细胞;ECs：内皮细胞

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如50×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如EC补充剂A(50×)需添加进基础培养基使其稀释50倍，使得补充剂终浓度为1×，配成诱导培养基1。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B、C、D、E，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基。例如诱导培养基1组成为基础培养基、1×浓度的EC补充剂A，若用量为10mL，配制方法为9.8mL基础培养基+200 μL补充剂A(50×)。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、DAY 0-7:神经外胚层阶段

(1) 基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合(基质胶:DMEM/F12=1:100)，铺板，备用。

(2) DAY -2: 当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。

(3) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。

(4) 3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5) 从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。

(6) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的hESC/iPSC 完全培养基(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(7) 按2.1×104 cells/cm²密度接种到步骤1制备的基质胶包被的板上，在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中6孔板。标记为Day -2，持续培养48小时(每天换液，换液培养基不含10μM Y-27632)。

(8) DAY 0: 吸去培养基，并加入2mL 诱导培养基1(成分为：基础培养基，1×EC补充剂A)培养24 小时。

(9) DAY 1:吸去培养基，并加入2mL 诱导培养基2(成分为：基础培养基，1×EC补充剂B)培养24 小时。

注：基质胶使用时需在冰上操作，所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷，基质胶超过10℃将迅速凝固，导致铺板失败。

三、DAY 2-6:内皮细胞阶段

(1) DAY 2： 第2天，使用2mL预热的诱导培养基3(成分为：基础培养基，1×EC补充剂C)换液。

(2) 根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基3换液，直到第4天。

(3) DAY 4： 第4天，使用2mL预热的诱导培养基4(成分为：基础培养基，1×EC补充剂D)换液。

(4) 根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基4换液，直到第6天。

注：注意每天观察培养基颜色及时换液。

四、内皮细胞维持培养阶段

(1) DAY 6: 第14天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。

(2) 每孔加入1mL的室温Accutase，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育2-5 min。

(3) 细胞解离后使用等体积的DMEM/F12中止消化，室温下300 g离心3 min，仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的内皮细胞维持培养基(成分为：内皮细胞维持基础培养基，1×EC补充剂E)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(4) 以1：3比例接种在基质胶包被的板上传代，每2-3天换一次液，当密度达到90%左右可按上述步骤传代，或使用逸漠生物无血清细胞冻存液冻存。