hPSC诱导分化视网膜色素上皮细胞试剂盒

产品描述

本试剂盒专为人诱导多能干细胞(hPSC)高效定向分化为视网膜色素上皮细胞(RPE)而设计，提供标准化、无血清、化学成分明确的培养体系，适用于疾病模型构建、药物筛选及细胞治疗研究，获得的RPE能表达特异性标志物(如 MITF、PAX6等)，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对细胞长期培养具有一定了解。

以六孔板为例，本产品提供的规格可供至少2个孔的hPSC诱导分化，最终可获得至少2倍于初始细胞量的成熟RPE，以及可供获得的RPE扩增一代。

本产品分化流程图

hPSC：人多能干细胞;RPE：视网膜色素上皮细胞

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如5×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(5×)需添加进基础培养基使其稀释5倍，使得补充剂终浓度为1×，配成诱导培养基1。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

(1)在 4℃解冻 补充剂 A、B、C、D，不要在 37℃条件下解冻。

(2)在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如诱导培养基1组成为基础培养基、1×浓度的补充剂A，若用量为50mL，

配制方法为40 mL基础培养基+10 mL补充剂A(5×)。

(3)分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、hESC培养和准备(详见 hESC/iPSC细胞培养试剂盒使用说明书)

三、DAY 0-7:神经外胚层阶段

(1)基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合(基质胶:DMEM/F12=1:100)，铺板，备用。

(2)DAY -1: 当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。

(3)加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。

(4)3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5)从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。

(6)离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的hESC/iPSC 完全培养基(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(7)按1：2-1：3比例将细胞接种到步骤1制备的基质胶包被的板上，在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。

(8)DAY 0: 24h后吸去培养基(密度应为90%左右)，并加入2mL 诱导培养基1(成分为：基础培养基，1×补充剂A)。

(9)根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基1换液，直到第7天。

注：①基质胶使用时需在冰上操作，所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷，基质胶超过10℃将迅速凝固，导致铺板失败。

②若细胞密度未达到90%左右，可继续使用hESC/iPSC 完全培养基换液培养至要求密度。

四、DAY 7-14:RPE祖细胞阶段

(1)DAY 7： 第7天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。使用2mL预热的诱导培养基2(成分为：基础培养基，1×补充剂B)换液。

(2)根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基2换液，直到第14天。

注：此阶段培养基容易变黄，注意每天观察及时换液。

五、DAY 14-42: RPE成熟阶段

DAY 14: 第14天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。

(2)每孔加入1mL的室温Tryple，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育5-10 min。

(3)5-10min后每孔加入1mL DMEM/F12中止消化，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。

(4)将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心3 min。

(5)仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的诱导培养基3(成分为：基础培养基，1×补充剂C)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(6)按1：2比例将细胞接种到提前制备的基质胶包被的6孔板中。

(7)根据培养基颜色每天或隔天更换培养基，直到第42天。

(8)第42天可检测到RPE标志物BEST、MITF、PAX6。

注：①第30-40天左右，RPE(观察具有黑色素的细胞)会逐渐在高密度区域出现。

②不同细胞株分化效率不同，若持续分化失败，请更换细胞株。

六、DAY 42: RPE维持培养阶段

(1)DAY 42: 第42天，吸去培养基，每孔加入1mL TrypLE消化10min去除杂细胞，PBS清洗一遍，再次使用TrypLE消化35min使得RPE细胞解离。

(2)细胞解离后使用等体积的DMEM/F12中止消化，室温下300 g离心3 min，仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的RPE维持培养基(成分为：RPE维持基础培养基，1×补充剂D)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

以1：4-1：5比例传代，每2-3天换一次液，每三周传一次代，最多可传3代。