hPSC诱导分化肝实质细胞试剂盒

产品描述

本产品为人多能干细胞向肝实质细胞诱导分化试剂盒，分化获得的细胞具有分泌白蛋白等肝实质细胞特有能力，能表达特异性标志物(如 ALB、CYP3A4 等)，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对细胞培养具有一定了解。

以六孔板为例，本产品提供的规格可供6个孔的hPSC(约1.2×10⁷个细胞)诱导分化。

本产品分化流程图

hPSC：人多能干细胞，DE：内胚层，HB：肝母细胞，Hepatocyte：肝实质细胞

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如10×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(10×)需添加进基础培养基1使其稀释10倍，使得补充剂终浓度为1×，配成DE诱导培养基1。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻补充剂 A、B、C、D，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如DE诱导培养基1组成为基础培养基1、1×浓度的补充剂A，若用量为12 mL，配制方法为10.8 mL基础培养基1+1.2 mL补充剂A(10×)。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：所有补充剂可根据使用量进行分装冻存，或按比例配成完全培养基后进行分装冻存以避免反复冻融。

二、hESC培养和准备(详见 hESC/iPSC细胞培养试剂盒使用说明书)

(http://www.immocell.com/xiazai/hESC(H1)%E5%9F%B9%E5%85%BB%E8%AF%B4%E6%98%8E%E4%B9%A6.pdf操作说明书)

三、DAY 0-2: 内胚层(DE)诱导阶段(hESC向DE诱导)

(1) DAY 0: hESC接种在Matrigel-GFR生长，当hESC的汇合度达到80%以上时，吸去培养基。加入2mLDE诱导培养基1(成分为：基础培养基1，1×补充剂A)培养24h。

(2) DAY 1：每孔使用2mL DE诱导培养基2(成分为：基础培养基1，1×补充剂B)进行换液，继续培养24 h。

四、DAY 2-7: 肝母细胞(HB)诱导阶段(内胚层向HB诱导)

(1) DAY 2：每孔使用2mL HB诱导培养基(成分为：基础培养基2，1×补充剂C)进行换液，培养至第7天，期间隔天换液。

五、DAY 7-18: 肝实质细胞诱导阶段(HB向肝实质细胞诱导)

(1) DAY 7: 每孔使用2mL 肝实质细胞诱导培养基(成分为：基础培养基3，1×补充剂D)进行换液，培养至第18天，期间隔天换液，直到DAY 18 。

(2) DAY 18: 吸弃培养基，每孔加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温重组胰蛋白酶消化液(含EDTA，不含酚红)，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中孵育3-5min，使其解离成单细胞。

(3) 3-5min后，使用等体积肝实质细胞诱导培养基含Y-27632(10 μM)终止消化，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将单细胞悬液收集到15mL离心管中，室温下50g离心2 min。

(4) 离心结束，充分去除上清，可使用无血清细胞冻存液进行冻存，或使用将1 mL预热的肝实质细胞诱导培养基重悬，按实验需求细胞密度接种于Matrigel-GFR包被的皿或板上进行培养。

注：肝实质细胞可使用肝实质细胞诱导培养基维持培养。Matrigel-GFR使用方法参考产品说明书。若细胞难以消化，可适当延长消化时间。