hPSC诱导分化多巴胺神经元祖细胞试剂盒

产品描述

本产品为人多能干细胞向多巴胺神经元祖细胞(DAP)诱导分化试剂盒，分化获得的细胞能表达人脑多巴胺神经元祖细胞标志物(如Tuj 1、FOXA2、LMX1A 等)、能用于多巴胺神经元分化，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对贴壁细胞培养具有一定了解。

以六孔板为例，本产品提供的规格可供两个孔的hPSC诱导分化，最终可获得6个孔的多巴胺神经元祖细胞(至少1.2×107个细胞)。

本产品分化流程图

hPSC：人多能干细胞;mNPC：中脑神经祖细胞;mDAP: 中脑多巴胺神经元祖细胞

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如50×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(50×)和补充剂B(10×)需添加进基础培养基使其分别稀释50倍以及10倍，使得补充剂终浓度为1×，配成mNPC诱导培养基(0-2)。包被液浓度250 U/mL表示每毫升有250个单位的包被蛋白，在本方案中铺板时，每平方厘米需要2个单位的包被蛋白。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B、C、D，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如mNPC诱导培养基(0-2)组成为基础培养基、1×浓度的补充剂A、B，若用量为10mL，配制方法为8.8 mL基础培养基+200μL补充剂A(50×)+1 mL补充剂B(10×)。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：补充剂B使用时尽量避光，且所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、hESC培养和准备(详见 hESC/iPSC细胞培养试剂盒使用说明书)

三、DAY 0-9: hESC分化为中脑神经祖细胞(mNPC)

(1) 包被液在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合，按2 U/cm2的包被密度铺板，备用。低生长因子基质胶(GFR Matrigel )4℃下解冻，按1:100的稀释比使用DMEM/F12进行稀释，一般六孔板每孔加2 mL稀释后的GFR Matrigel ，其他板按底面积换算。

(2) DAY 0: 当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。

(3) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。

(4) 3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5) 从包被液包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏涂层表面。

(6) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的mNPC诱导培养基(0-2)(成分为：基础培养基，1×补充剂A，1×补充剂B)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(7) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将细胞接种到步骤1制备的包被板上使得最终密度为6.0 -8.0×104个细胞/cm2，在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育48 h(若24 h后培养基变黄则及时用含10μM Y-27632 的mNPC诱导培养基换液(0-2))。

(8) DAY 2：使用mNPC诱导培养基(2-7)换液(成分为：基础培养基，1×补充剂A，1×补充剂C)，直到第7天。

(9) DAY 7：使用mNPC诱导培养基(7-9)换液(成分为：基础培养基，1×补充剂A，1×补充剂D)，培养至第9天。可取第9天的细胞进行免疫荧光染色检测NPC标志物如SOX2、Nestin。

注：包被液或GFR Matrigel 使用时需在冰上操作，所有与包被液和GFR Matrigel直接接触的物品需提前预冷。包被液和GFR Matrigel包被板后可在4℃保存，尽量于1周内使用,使用前需置于室温1h或37℃培养箱孵育30分钟以上，以恢复至室温。

四、DAY 9-14: mNPC诱导分化为中脑多巴胺神经元祖细胞(mDAP)

(1) DAY 9： 第9天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。

(2) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。

(3) 3-5min后，将DMEM/F12(含10μM Y-27632)以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(4) 从包被液包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏涂层表面。

(5) 离心结束，充分去除上清，将适量预热的mDAP诱导培养基(成分为：基础培养基，1×补充剂A)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。按1:3比例接种在包被液包被的板中，每孔加入2 mL细胞悬液于37℃、5%CO2细胞培养箱培养24h 。

(6) DAY 11: 第11天开始根据培养基颜色每天或隔天更换一次mDAP诱导培养基，直到第14天。可取第14天的细胞进行免疫荧光染色检测DAP标志物如FOXA2、Tuj1、LMX1A。

注：D14天的mDAP可用逸漠生物神经细胞无血清冻存液(推荐使用)在液氮中冷冻。

五、 mDAP维持培养阶段

(1) DAY 14: 第14天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。

(2) 每孔加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育5 min。

(3) 5min后每孔加入1mL DMEM/F12(含10μM Y-27632)，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。

(4) 将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5) 仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的mDAP维持培养基(成分为：基础培养基，1×补充剂A，1×补充剂E)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(6) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将细胞按1:3传代比例接种到提前制备的GFR Matrigel 包被的6孔板上(使用前弃去孔内培养基)，根据培养基颜色每天或隔天换液。

(7) 当细胞密度达到90%-95%时，进行传代，传代步骤见步骤(1)-步骤(6)。

注：mDAP可传5-6代，传代次数越多，细胞越倾向于向多巴胺神经元自发分化。