hPSC诱导分化感觉神经元试剂盒

产品描述

本试剂盒专为人多能干细胞(hPSC)高效定向分化为感觉神经元细胞(Sensory neurons cell，SN)而设计，提供标准化、无血清、化学成分明确的培养体系，适用于疾病模型构建、药物筛选及细胞治疗研究，获得的SN能表达特异性标志物(如 Peripherin、TrkA、Tuj1等)，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对细胞长期培养具有一定了解。

以六孔板为例，本产品提供的规格可供2个孔的hPSC诱导分化，最终可获得至少8倍于初始细胞量的成熟SNC。

本产品分化流程图

hPSC：人多能干细胞;NCC：神经脊细胞;Nociceptor：伤害感受器;SNC：感觉神经元

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如25×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(25×)需添加进基础培养基使其稀释25倍，使得补充剂终浓度为1×，配成SNC诱导培养基。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hiPSC及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B、C、D，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如SNC诱导培养基A组成为SNC诱导基础培养基、1×浓度的补充剂A，若用量为5mL，配制方法为4.8 mL基础培养基+200 µL补充剂A(25×)。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、DAY 0-12: SNC诱导阶段

(1) 基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合(生长因子减量基质胶:DMEM/F12=1:100)，铺板，备用。

(2) DAY -1: 当hESC的汇合度达到85%-90%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。

(3) 加入1mL含Y-27632(10μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。

(4) 3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5) 从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。

(6) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的hESC/iPSC 完全培养基(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(7) 按1：2-1：3比例将细胞接种到步骤1制备的生长样子减量基质胶包被的板上，培养24小时。

(8) DAY 0: 24小时后(此时细胞密度应达到95%以上)，吸去培养基，并加入2mL SNC诱导培养基A换液(成分为：SNC诱导基础培养基，1×补充剂A)。

(9) 每天使用SNC诱导培养基A换液，直到第2天。

(10) DAY 2: 从培养物中抽吸培养基，并加入2mL SNC诱导培养基B换液(成分为：SNC诱导基础培养基，1×补充剂B)，每天换液直至第7天。

(11) DAY 7: 从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。

(12) 每孔加入1mL含Y-27632(5 μM)的室温Accutase，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育3-5 min。

(13) 3-5min后每孔加入1mL DMEM/F12(含5 μM Y-27632)中止消化，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(14) 仔细吸弃上清液，不干扰细胞，加入适量预热的含5μM Y-27632 的SNC诱导培养基C(成分为：SNC诱导基础培养基，1×补充剂C)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(15) 按1：2比例进行传代，接种到生长样子减量基质胶包被的板上，确保每孔培养基体积达到2mL，培养24小时。

(16) DAY 8: 从培养物中抽吸培养基，并加入不含Y-27632的2mL SNC诱导培养基C换液(成分为：SNC诱导基础培养基，1×补充剂C)，每天换液直至第12天。

注：基质胶使用时需在冰上操作，所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷，基质胶超过10℃将迅速凝固，导致铺板失败。

三、DAY 12-30: SNC成熟阶段

(1) DAY 12：从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。

(2) 每孔加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育3-5 min。

(3) 3-5min后每孔加入1mL DMEM/F12(含10μM Y-27632)中止消化，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(4) 仔细吸弃上清液，不干扰细胞，加入适量预热的含10μM Y-27632 的SNC成熟基础培养基(不添加补充剂D)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(5) 按1：2比例进行传代，接种到生长样子减量基质胶包被的板上，确保每孔培养基体积达到2mL，培养24小时。

(6) DAY 13:从培养物中抽吸培养基，并加入不含Y-27632的2mL SNC成熟培养基换液(成分为：SNC成熟基础培养基，1×补充剂D)，之后每2-3天换液培养直至第30天。第30天可检测SNC特异性标志物如 Peripherin、TrkA、Tuj1、等。

注：①由于细胞密度高，培养基容易变黄，注意每天观察及时换液。

②分化第12天可检测感觉神经元前体标志物S0X10、BRN3A or ISL1来验证分化方向是否正确。

③分化第15天可使用1μg/mL Mitomycin C(HY-13316，MCE)处理2-4.5h进行纯化，纯化后可获得高纯度的感觉神经元。

④该方案获得的感觉神经元可在SNC维持培养基中长期培养，并表达伤害性感受器的典型标志物。

⑤不同多能干细胞细胞株的分化效率不一样，若分化效率持续低下或持续分化失败，建议更换细胞株。