运动神经元祖细胞诱导分化运动神经元试剂盒

产品描述

本产品为运动神经元祖细胞向运动神经元诱导分化试剂盒，可用于分化获得的运动神经元能表达运动神经元的特异性标志物(如 CHAT 等)，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对神经元培养具有一定了解。

以六孔板为例，本产品提供的规格可供6个孔的运动神经元祖细胞诱导分化，最终可获得6个孔的成熟运动神经元(约1.2×107个细胞)。

本产品分化流程图

MNP：运动神经元前体细胞;MN：运动神经元;mMN：成熟运动神经元

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如2000×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(2000×)和补充剂B (50×)需添加进基础培养基使其分别稀释2000倍以及50倍，使得补充剂终浓度为1×，配成MN诱导培养基。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如MN诱导培养基组成为基础培养基、1×浓度的补充剂A和1×浓度的补充剂B，若用量为20mL，配制方法为19950μL基础培养基+10μL补充剂A(2000×)+400μL补充剂B(50×)。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：补充剂A使用时尽量避光，且所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、运动神经元祖细胞培养和准备(详见 运动神经元祖细胞(MNP)维持培养基使用说明书)

三、DAY 0-6: MNP诱导分化为运动神经元(MN)

(1) DAY 0: 第0天，当MNP密度达到100%时，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。

(2) 每孔加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育3-5 min。

(3) 3-5min后每孔加入1mL DMEM/F12(含10μM Y-27632)，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。

(4) 将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5) 仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的MN诱导培养基(成分为：基础培养基，1×补充剂A，1×补充剂B)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(6) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将细胞按一定比例(一般为1:3或1:4)接种到提前制备的基质胶包被的6孔板上使得24h后密度为80%或90%以上。

(7) DAY 1: 更换为不含Y-27632的MN诱导培养基。每隔一天更换培养基，直到第6天。

(8) 第6天可检测到神经元标志物(TuJ1)， 运动神经元标志物(PHOX2B 、PRPH、ISL1、ISL2)的表达

注：Motor Neuron 贴壁较松，换液时要特别轻柔。

注：基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合(基质胶:DMEM/F12=1:100)，铺板，备用。

注：基质胶使用时需在冰上操作，所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷，基质胶超过10℃将迅速凝固，导致铺板失败。

四、DAY 6-16: MN成熟阶段

(1) DAY 6: 第6天，吸去培养基，每孔加入2mL MN成熟培养基(成分为：基础培养基，1×补充剂B)。

(2) 隔天换液，直到第16天获得成熟MN(mMN)。

(3) mMN可用MN成熟培养基继续维持培养。

(4) 这一阶段可检测到CHAT的表达。

注：Motor Neuron 贴壁较松，换液时要特别轻柔。