多巴胺神经元祖细胞诱导分化多巴胺神经元试剂盒

产品描述

本产品为多巴胺神经元祖细胞向多巴胺神经元诱导分化试剂盒，分化获得的多巴胺神经元能表达人脑多巴胺神经元的特异性标志物(如 TH、DAT、GIRK2 等)，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对神经元培养具有一定了解。

以六孔板为例，本产品提供的规格可供6个孔的多巴胺神经元祖细胞诱导分化，最终可获得6个孔的成熟多巴胺神经元(至少1.2×107个细胞)。

本产品分化流程图

mDAP：中脑多巴胺元祖细胞;mDA：中脑多巴胺神经元;

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如50×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(50×)和补充剂B(50×)需添加进基础培养基1使其分别稀释50倍以及50倍，使得补充剂终浓度为1×，配成mNPC诱导培养基(0-2)。诱导包被液浓度85.7 U/mL表示每毫升有85.7250个单位的包被蛋白，在本方案中铺板时，每平方厘米需要2个单位的包被蛋白。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如mDA诱导培养基组成为基础培养基1、1×浓度的补充剂A，若用量为8mL，配制方法为7840μL基础培养基1+160μL补充剂A(50×))。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、中脑多巴胺元祖细胞培养和准备(详见 中脑多巴胺元祖细胞维持培养基使用说明书)

三、DAY 0-10: mDAP诱导分化为中脑多巴胺神经元(mDA)

(1) DAY 0： 第0天，当mDAP密度达到100%时，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。

(2) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。

(3) 3-5min后，将DMEM/F12(含10μM Y-27632)以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(4) 从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏涂层表面。

(5) 离心结束，充分去除上清，将适量预热的mDA诱导培养基(成分为：基础培养基1，1×补充剂A)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。按1:3比例接种在基质胶包被的板中，每孔加入2 mL细胞悬液于37℃、5%CO2细胞培养箱培养24h 。

(6) DAY 10: 第2天开始根据培养基颜色每天或隔天更换一次mDA诱导培养基，直到第10天。

注：D10的mDA可用逸漠生物神经细胞无血清冻存液(推荐使用)在液氮中冷冻。

注：基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合(基质胶:DMEM/F12=1:100)，铺板，备用。

注：基质胶使用时需在冰上操作，所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷，基质胶超过10℃将迅速凝固，导致铺板失败。

四、DAY 10-27: mDA成熟阶段

(1) DAY 10: 第10天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。

(2) 每孔加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育5 min。

(3) 5min后每孔加入1mL DMEM/F12(含10μM Y-27632)，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。

(4) 将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5) 仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的mDA成熟培养基(成分为：基础培养基2，1×补充剂B)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(6) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将细胞接种到提前制备的包被液包被的6孔板上使得密度为6-8×105个细胞/cm2,根据培养基颜色每天或隔天换液，直到第25天。

(7) DAY 12: 更换为不含Y-27632的mDA成熟培养基。根据培养基颜色每天或隔天换液，直到第27天。

(8) 第27天可检测到神经元标志物(MAP2)，多巴胺神经元标志物(TH、DAT、GIRK2)的表达。

注：由于细胞密度较高，注意及时换液。