hPSC诱导分化星形胶质细胞(AST)试剂盒

产品描述

本试剂盒专为人诱导多能干细胞(hPSC)高效定向分化为星形胶质细胞(AST)而设计，提供标准化的培养体系，适用于疾病模型构建、药物筛选及细胞治疗研究，获得的AST能表达特异性标志物(如GFAP、S100β等)，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对细胞长期培养具有一定了解。

以六孔板为例，本产品提供的规格可供2个孔的hPSC诱导分化，最终可获得2倍于初始细胞量的成熟AST以及一定数量的NPC、APC和未成熟AST。

本产品分化流程图

hPSC：人多能干细胞;NPC：神经前体细胞;APC：星形胶质细胞祖细胞;AST：星形胶质细胞

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如50×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(50×)需添加进基础培养基1使其稀释50倍，使得补充剂终浓度为1×，配成诱导培养基1。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hiPSC及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B、C、D，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如诱导培养基1组成为基础培养基1、1×浓度的补充剂A，若用量为40mL，配制方法为39.2 mL基础培养基+800μL补充剂A(50×)。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、DAY 0-9:NPC诱导阶段

(1) 基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合(基质胶:DMEM/F12=1:100)，铺板，备用。

(2) DAY 0: 当hPSC的汇合度达到80%-90%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hPSC，吸去PBS。

(3) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中5-7min，使其解离成单细胞。

(4) 5-7min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5) 从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。

(6) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的诱导培养基1(成分为：基础培养基1，1×补充剂A)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(7) 按60,000–80,000 cells/cm2的密度(约1：3传代比例)将细胞接种到步骤1制备的基质胶包被的板上，在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。

(8) DAY 1: 24 h后吸去培养基，并加入2mL 诱导培养基1(成分为：基础培养基1，1×补充剂A)。

(9) 根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基1换液，直到第9天。

注：基质胶使用时需在冰上操作，所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷，基质胶超过10℃将迅速凝固，导致铺板失败。

三、DAY 9-16:NPC扩增阶段

(1) DAY 9： 第9天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。

(2) 加入1 mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中4 min，使其解离成单细胞。

(3) 4 min后每孔加入1 mL DMEM/F12中止消化，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。

(4) 将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心3 min。

(5) 仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1 mL恢复室温的诱导培养基2(成分为：基础培养基1，1×补充剂B)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(6) 按1：4比例将细胞接种到提前制备的基质胶包被的6孔板中。在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24 h。

(7) DAY 10: 24 h后吸去培养基，并加入2 mL 诱导培养基2(成分为：基础培养基1，1×补充剂B)。

(8) 根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基2换液，直到第16天。

注：①若Accutase消化4min消化不下，可适当延长消化时间。

②此阶段培养基容易变黄，注意每天观察及时换液。

③试剂盒提供的培养基在此阶段可提供六孔板4孔的量分化，剩余NPC可使用无血清细胞冻存液冻存，复苏可使用该阶段培养基或逸漠生物神经干/祖细胞扩增培养基(货号：IMI-SP01AM)复苏。

四、DAY 16-25: APC诱导阶段

(1) DAY 16: 第16天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。使用2 mL预热的诱导培养基3(成分为：基础培养基2，1×补充剂C)换液。

(2) 每隔一天更换培养基，直到第25天。

注：①第16天，确保细胞的密度为90%–100%，再进入下一阶段，若未达到90%密度，可适当延长该阶段的培养时间。

②不同细胞株分化效率不同，若持续分化失败，请更换细胞株。

五、DAY 25: AST成熟阶段

(1) DAY 25: 第25天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。

(2) 加入1 mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-4 min，使其解离成单细胞。

(3) 3-4 min后每孔加入1 mL DMEM/F12中止消化，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。

(4) 将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心3 min。

(5) 仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1 mL恢复室温的成熟培养基(成分为：基础培养基3，1×补充剂D)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(6) 按1：6比例将细胞接种到提前制备的基质胶包被的6孔板中。在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24 h。

(7) DAY 26: 24 h后吸去培养基，并加入2 mL 成熟培养基(成分为：基础培养基3，1×补充剂D)

(8) 之后每隔一天换液，每7天传一次代，直到第53天。

(9) 第53天可检测到AST标志物GFAP、S1OOβ。

注：①细胞每次传代都需要加Y27632(终浓度10μM)，第二天更换为正常培养基。

②本试剂盒提供的规格可供六孔板4孔的AST成熟，所以传代后剩余细胞可用无血清细胞冻存液(IMC-701)冻存，或进行相关鉴定。

③第53天的细胞可用无血清细胞冻存液(IMC-701)冻存，或继续用成熟培养基维持培养传代，可传3代。

④首次实验建议少批量分化。

⑤若该阶段培养基不足，可购买逸漠生物星形胶质细胞(AST)维持培养基(货号IMI-AT01M)，分化25天后的AST复苏传代培养也可使用该培养基。