hPSC诱导分化前脑神经干祖细胞（fNSPC）试剂盒

产品描述

本产品为人多能干细胞向前脑神经干/祖细胞(fNSPC)诱导分化试剂盒，分化获得的FNSPC能表达前脑神经干细胞或前体细胞的特异性标志物(如FOXG1、PAX6、SOX2、Nestin 等)，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对多能干细胞2D诱导分化以及神经球培养具有一定了解。

以六孔板为例，本产品提供的规格可供16孔的hPSC诱导分化。

本产品分化流程图

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如50×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(50×)和补充剂B (100×)需添加进NSPC诱导基础培养基使其分别稀释50倍以及100倍，使得补充剂终浓度为1×，配成NSPC诱导培养基。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B、C，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如fNSPC诱导培养基组成为fNSPC诱导基础培养基、1×浓度的补充剂A和1×浓度的补充剂B，若用量为50 mL，配制方法为48.5mL fNSPC诱导基础培养基+1 mL补充剂A(50×)+500μL补充剂B(100×)。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用，或于-20℃可储存2-3个月。

注：补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、DAY 0-10: hESC分化为前脑神经干/祖细胞(fNSPC)

(1) 基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合(基质胶:DMEM/F12=1:100)，铺板，备用。

(2) DAY 0: 当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。

(3) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。

(4) 3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将单细胞悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5) 从步骤(1)包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏涂层表面。

(6) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的fNSPC诱导培养基(成分为：fNSPC诱导基础培养基，1×补充剂A，1×补充剂B)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(7) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将细胞接种到步骤1制备的包被板上使得最终密度为6.0 -8.0× 104个细胞/cm2，在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24 h。

(8) DAY 1: 24h后(此时细胞密度应达到90%以上)吸去培养基，并加入不含2mL Y-27632的fNSPC诱导培养基，每天或隔天换液直到第10天。

(9) 可取第10天的细胞进行免疫荧光染色检测fNSPC标志物如FOXG1、PAX6、SOX2、SOX1、Nestin。

注：包被液使用时需在冰上操作，所有与包被液直接接触的物品需提前预冷。

三、fNSPC维持培养阶段

(1) DAY 10： 第10天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。

(2) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。

(3) 3-5min后，将DMEM/F12(含10μM Y-27632)以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(4) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的fNSPC扩增培养基(成分为：fNSPC扩增基础培养基，1×补充剂C)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(5) 按1：4-1:6比例将细胞接种到提前制备的基质胶包被的6孔板中。在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24 h。

(6) 24h后，换成不含Y-27632的fNSPC扩增培养基，视培养基颜色隔天换液。

注： fNSPC可使用逸漠生物神经细胞无血清冻存液在液氮中冷冻。

四、fNSPC传代

(1) 从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。

(7) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min。

(2) 3-5 min后每孔加入1mL fNSPC扩增培养基(含10μM Y-27632)，轻轻吹打细胞，使细胞解离成小团块或单细胞。

(3) 将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(4) 仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的fNSPC扩增培养基重悬细胞，轻轻地上下移液以确保细胞溶液均匀。

(5) 按1：4比例将细胞接种到提前制备的基质胶包被的6孔板中。在6孔板中每孔最终体积为2 mL，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育。

注：仅分化结束收获细胞时第一天必须添加10 μM Y-27632，后续传代第一天不需要添加10 μM Y-27632。