hPSC来源前脑神经干祖细胞(iPSC) fNSPC(iPSC)

培养操作

1)复苏细胞：将含有 1 mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 4 mL 前 脑神经干/祖细胞扩增培养基(含 10 μM Y-27632)混合均匀。在 1000 rpm 条件下离心 3 min， 弃去上清液，加 1-2 mL 前脑神经干/祖细胞扩增培养基(含 10μM Y-27632)后吹匀。然后将 所有细胞悬液加入含适量前脑神经干/祖细胞扩增培养基(含 10μM Y-27632)的低吸附六孔 板(1 孔)或低吸附 35mm 皿中培养过夜。24h 后，100g 离心弃去上清，换成不含Y-27632 的 前脑神经干/祖细胞扩增培养基，视培养基颜色或隔 2 天半量换液。

2)细胞传代：当神经球直径达 100-150 μm 时，即可进行传代培养。

a 、100g 离心弃去上清，加入 1-2 mL Accutase(含 10 μM Y-27632)，置于 37℃水浴消化 10-15 min。

b 、10-15 min 后每孔加入等量 前脑神经干/祖细胞扩增培养基，轻轻吹打细胞，使细胞解 离成小团块或单细胞。

c 、将细胞悬液收集到 15 mL 离心管中，室温下 300 g 离心 5 min。

d 、仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用 1mL 恢复室温的前脑神经干/祖细胞扩增培养基重 悬细胞，轻轻地上下移液以确保细胞溶液均匀。

e 、使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，使用前脑神经干/祖细胞扩 增培养基稀释细胞，将细胞以5×105/mL(或 1:2-1:3 比例)接种到低吸附六孔板中。

3)细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面以低吸附 T25 为例;

a、收集细胞及细胞培养液，装入离心管中，100g 离心 5 min，弃上清液，加入 2 mL Accutase (含 10 μM Y-27632)水浴消化 15 min ，。

b、根据细胞数量加入神经细胞无血清冻存液，使细胞密度 1 × 106~ 1 × 107/mL，轻轻混匀， 每支冻存管冻存 1mL 细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c 、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h 后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

培养注意事项

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发 生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、所需细胞因子等， 确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用 75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变 化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将 T25 瓶置于 37℃培养箱放置 2-4h。

4. 客户可购买逸漠生物前脑神经干/祖细胞扩增培养基(货号 IMI-FC01AM)。

5. 建议客户收到细胞后前 3 天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交 流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具 体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。

6.该细胞仅供科研使用。

7. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养 条件新配制的完全培养基来培养细胞。

8. 注意： 1:2 传代就是 1 个 T25 瓶传 2 个 T25 瓶或者 1 个六孔板(或按照底面积换算)，必 须使用低吸附培养器皿，或经过特殊液体润洗使得细胞难以贴于培养器皿表面。