hPSC诱导分化皮质神经元试剂盒

产品描述

本试剂盒专为人多能干细胞(hPSC)高效定向分化为皮质神经元细胞(Cortical neuron，CN)而设计，提供标准化、无血清、化学成分明确的培养体系，适用于疾病模型构建、药物筛选及细胞治疗研究，获得的CN能表达特异性标志物(如 Ctip2、MAP2、PAX6等)，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对细胞长期培养具有一定了解。

以六孔板为例，本产品提供的规格可供2个孔的hPSC诱导分化，最终可获得至少12倍于初始细胞量的成熟CN。

本产品分化流程图

hPSC：人多能干细胞;fNPC：前脑神经祖细胞;CNP：皮质神经元前体细胞;CN：皮质神经元

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如50×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(50×)需添加进基础培养基使其稀释50倍，使得补充剂终浓度为1×，配成fNPC诱导培养基。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hiPSC及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B、C，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如fNPC诱导培养基组成为基础培养基、1×浓度的补充剂A，若用量为40mL，配制方法为39.2 mL基础培养基+800 µL补充剂A(50×)。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、DAY 0-10:fNPC诱导阶段

(1) 基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合(生长因子减量基质胶:DMEM/F12=1:100)，铺板，备用。

(2) DAY -1: 当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。

(3) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。

(4) 3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5) 从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。

(6) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的hESC/iPSC 完全培养基(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(7) 按1：2-1：4比例将细胞接种到步骤1制备的生长样子减量基质胶包被的板上，培养24小时。

(8) DAY 0: 24小时后(此时细胞密度应达到90%以上)，吸去培养基，并加入2mL fNPC诱导培养基换液(成分为：基础培养基，1×补充剂A)。

(9) 根据培养基颜色每天或隔天使用fNPC诱导培养基换液，直到第10天。

注：基质胶使用时需在冰上操作，所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷，基质胶超过10℃将迅速凝固，导致铺板失败。

三、DAY 10-20: 皮质神经元前体细胞(CNP)阶段

(1) DAY 10： 从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。

(2) 每孔加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育3-5 min。

(3) 3-5min后每孔加入1mL DMEM/F12(含10μM Y-27632)中止消化，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(4) 仔细吸弃上清液，不干扰细胞，加入适量预热的含10μM Y-27632 的CNP诱导培养基(成分为：基础培养基，1×补充剂B)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(5) 按1：3比例进行传代，确保每孔培养基体积达到2mL。

(6) 第11天更换为不含Y-27632的CNP诱导培养基，根据培养基颜色每天或隔天使用CNP诱导培养基换液，直到第20天。

四、DAY 20-30: 皮质神经元(CN)成熟阶段

(1) DAY 20: 从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。

(2) 每孔加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育3-5 min。

(3) 3-5min后每孔加入1mL DMEM/F12(含10μM Y-27632)中止消化，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(4) 仔细吸弃上清液，不干扰细胞，加入适量预热的10μM Y-27632 的CN成熟培养基(成分为：CN成熟基础培养基，1×补充剂C)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(5) 按1：2比例进行传代，确保每孔培养基体积达到2mL。

(6) 第21天更换为不含Y-27632的CN成熟培养基，根据培养基颜色每天或隔天使用CN成熟培养基换液，直到第30天。第30天可检测CN特异性标志物如 Ctip2、MAP2、PAX6等。

注：①由于细胞密度高，培养基容易变黄，注意每天观察及时换液。

②若第30天MAP2表达较弱，表明神经元未成熟，可继续使用CN成熟培养基培养10-20天。

③成熟皮质神经元冻存复苏后存活率较低，若需冻存，建议在D24-D28天进行冻存。推荐使用神经细胞无血清冻存液(IMC-704)冻存。

④基质胶、Laminin或其他适用养神经细胞的基质均可用于皮质神经元维持培养。

⑤不同多能干细胞细胞株的分化效率不一样，若分化效率持续低下或持续分化失败，建议更换细胞株。