hPSC诱导分化胰岛β细胞试剂盒

产品描述

本试剂盒专为人诱导多能干细胞(hPSC)高效定向分化为胰岛β细胞而设计，提供标准化、无血清、化学成分明确的培养体系，适用于疾病模型构建、药物筛选及细胞治疗研究，获得的胰岛β细胞细胞能表达特异性标志物(如 INS、C-peptide、NKX6.1等)，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对细胞长期培养具有一定了解。

以6孔板为例，本产品提供的规格可供至少6个孔的hPSC诱导分化。

本产品分化流程图

hPSC(human pluripotent stem cell)：人多能干细胞;DE(definitive endoderm)：内胚层;GTE(gut tube endoderm)：肠管内胚层;PE(pancreatic endoderm)：胰腺内胚层;PP(pancreatic progenitors)：胰腺祖细胞;EP(endocrine progenitors)：内分泌祖细胞;SC-β(Stem Cell-derived pancreatic β cells)：干细胞来源胰岛β细胞

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如25×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂S1a(25×)需添加进基础培养基1-2使其稀释25倍，使得补充剂S1a终浓度为1×，配成诱导培养基S1a。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻 补充剂，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如诱导培养基S1a组成为基础培养基1-2、1×浓度的补充剂S1a，若用量为12mL，配制方法为11.52 mL基础培养基1-2 + 0.48 mL补充剂S1a(25×)。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、DAY 0-4:第一阶段

(1) 基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合(基质胶:DMEM/F12=1:100)，铺板，备用。

(2) DAY -1: 当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。

(3) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。

(4) 3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5) 从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。

(6) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的hESC/iPSC 完全培养基(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(7) 按0.313-0.521×10⁶个细胞/cm2比例将细胞接种到步骤1制备的基质胶包被的板上，在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。

(8) DAY 0: 24h后吸去培养基(密度应为100%)，并加入2mL 诱导培养基S1a(成分为：基础培养基1-2，1×补充剂S1a)培养24h。

(9) DAY 1: 24h后吸去培养基，使用诱导培养基S1b(成分为：基础培养基1-2，1×补充剂S1b)换液，直到第4天，期间根据培养基颜色每天或隔天换液。

注：基质胶使用时需在冰上操作，所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷，基质胶超过10℃将迅速凝固，导致铺板失败。

三、DAY 4-7:第二阶段

(1) DAY 4： 第4天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。使用2mL预热的诱导培养基S2(成分为：基础培养基1-2，1×补充剂S2)换液。

(2) 根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基S2换液，直到第7天。

四、DAY 7-10:第三阶段

(1) DAY 7: 第7天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。使用2mL预热的诱导培养基S3(成分为：基础培养基3-4，1×补充剂S3)换液。

(2) 根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基S3换液，直到第10天。

五、DAY 10-14: 第四阶段

(1) DAY 10: 第10天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。使用2mL预热的诱导培养基S4(成分为：基础培养基3-4，1×补充剂S4)换液。

(2) 根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基S4换液，直到第14天。

六、DAY 14-21: 第五阶段

(1) DAY 14: 第14天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。使用2mL预热的诱导培养基S5a(成分为：基础培养基5，1×补充剂S5a)换液，培养24h。

(2) DAY 15: 第15天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。使用2mL预热的诱导培养基S5b(成分为：基础培养基5，1×补充剂S5b)换液，根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基S5b换液，直到第21天。

七、DAY 21-28: 第六阶段

(1) DAY 21: 第21天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。使用2mL预热的诱导培养基S6(成分为：基础培养基6，1×补充剂S6)换液，根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基S6换液，直到第28天。

(2) DAY 28: 第28天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。 每孔加入1mL的室温Tryple，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育3-5 min。

(3) 3-5min后每孔加入1mL DMEM中止消化，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。

(4) 将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心3 min。

(5) 仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的诱导培养基S6重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀，可按1：2比例接种于低吸附六孔板中，每孔使用诱导培养基S6补齐至2mL，可继续维持培养至少7天。

(6) 可取第28天或成球生长的细胞检测胰岛β细胞特异性标志物(如 INS、C-peptide、NKX6.1等)。

注：①第一次分化建议在12孔板分化，以熟悉分化流程与条件。

②不同细胞株分化效率不同，若持续分化失败，请更换细胞株。

八、hPSC来源SC-β的冻存与复苏

(1) 对于贴壁细胞：第28天的细胞消化收集后，使用胰岛细胞冻存液冻存(一般六孔板1孔可冻2管，12孔板1孔可冻1管)。

(2) 对于胰岛细胞球：将悬浮生长的胰岛细胞球100g离心3min，弃去上清，加入1毫升Accutase(含10µM Y27632)转移至孔板中，于37℃摇床90 rpm摇12-15min。之后加入1mL DMEM中止消化，转移至15mL离心管吹散，300g离心3min，弃去上清，加入胰岛细胞冻存液进行冻存(1-10×106个细胞一管;如果按第六阶段步骤5比例传代，可六孔板1孔冻一管)。

(3) 胰岛细胞复苏：将含有1 mL细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加10 mL DMEM培养基(含10μM Y-27632)混合均匀。在300g条件下离心3 min，弃去上清液，加2 mL 诱导培养基S6(含10μM Y-27632)后吹匀。转移至低吸附六孔板(1孔)或低吸附35mm皿中培养过夜。24h后，100g离心弃去上清，换成不含Y-27632的诱导培养基S6进行维持培养，隔天换液。

注：①复苏时六孔板1孔至少接种1×10⁶个细胞。

②若想确保悬浮长成的胰岛细胞球直径大小均一，可按六孔板每孔5×106个细胞使用诱导培养基S6+10µM Y27632接种于6孔板微孔板( STEMCELL Technologies, 27940)中300g离心5min，培养24h成球，24h后换成不含Y27632的诱导培养基S6转移至37℃摇床90rpm继续培养。