hPSC诱导分化胰腺类器官试剂盒

产品描述

本产品为hPSC诱导分化胰腺类器官试剂盒，人多能干细胞hPSC通过该试剂盒诱导分化可得到胰腺类器官，成熟后的胰腺类器官有类似腺泡、导管的结构。试剂盒可完成六孔板2个孔的hPSC的分化，最终获得约72个含胰腺类器官的基质胶滴。

本产品需要操作人员具有hPSC细胞培养经验，对类器官具有一定了解。

规格数量

试剂盒最多可以培养54个基质胶滴，每个胶滴约20个胰腺类器官。

实验仪器、材料

仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱

材料：细胞培养板(规格为：6孔、12孔、24孔)、离心管(规格为15 mL 和 50 mL)、移液器(规格为 10 μL、100 μL、1000 μL)、无菌吸头(规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL)、移液管(规格为10mL、50mL)

实验试剂

实验内容与方法

1、hPSC分化为内胚层细胞(DE)

(1)将6mL基础培养基1与20μL补充剂A、20μL补充剂B混合均匀，作为DE分化培养基1;将18mL基础培养基1与60μL补充剂B混合均匀，作为DE分化培养基2。

(2)当hPSC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，每孔加入2mL DE分化培养基1，记作D0，于37℃ 5%CO2培养箱中培养。

(3)第2天(D1)吸去培养基，每孔加入2mL DE分化培养基2，D2、D3每孔更换2mL DE分化培养基2，于37℃ 5%CO2培养箱中培养。

2、DE诱导分化为前肠内胚层细胞(AFE)

(1)将12mL基础培养基2与60μL补充剂C混合均匀，作为AFE分化培养基。

(2)D4、D5，每孔更换2mL AFE分化培养基，37℃ 5%CO2培养箱中培养。

3、AFE诱导分化为胰腺内胚层细胞(PE)

(1)将24mL基础培养基3与40μL补充剂D混合均匀，作为PE分化培养基。

(2)D6到D9，每天每孔更换2mL PE分化培养基，37℃ 5%CO2培养箱中培养。

4、PE诱导分化为胰腺祖细胞(PP)

(1)将50mL基础培养基4与100μL补充剂E混合均匀，作为PP分化培养基。

(2)D10、D11，每天每孔更换2mL PP分化培养基，37℃ 5%CO2培养箱中培养。

(3)D12，吸出培养基，用1 mL室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)洗涤1次。

(4)每孔加入1mL恢复室温的Accutase并在37℃、5% CO2培养箱中孵育5 min;5min后每孔加入1mL恢复室温的DMEM/F12，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。

(5)将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(6)仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL 室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(8)室温下以300 g离心5 min，吸弃上清，留20 μL细胞悬液，与预冷的基质胶混匀(6孔板一孔的细胞与180 μL Matrigel混合均匀，过程中避免产生气泡)。

(9)将200μL基质胶/细胞混合物按每孔30μL接种到24孔板中，即每个六孔板的细胞可以接种到24孔6个孔中。

(10)将板置于37℃、5%CO2培养箱中20-30分钟使基质胶凝固。

(11)每孔加入500μL PP分化培养基，37℃ 5%CO2培养箱中培养。

(12)D13，每孔更换500μL PP分化培养基，37℃ 5%CO2培养箱中培养。

5、PP进行胰腺(3D)类器官分化

(1)将40mL基础培养基5与40μL补充剂F混合均匀，作为胰腺(3D)类器官分化培养基。

(2)D14到D17，每天每孔更换500μL 胰腺(3D)类器官分化培养基，37℃ 5%CO2培养箱中培养。

6、胰腺(3D)类器官成熟

(1)将200mL基础培养基6与200μL补充剂G混合均匀，作为胰腺(3D)类器官成熟培养基。

(2)D18，每孔更换500μL 胰腺(3D)类器官成熟培养基，37℃ 5%CO2培养箱中培养。

(3)D21，预冷基质胶和枪头。

(4)吸去培养基，每孔加入1mL预冷的PBS(不含Ca2+/Mg2+)，吹打2-3次，收集到15mL离心管中。

(5)300g离心5min。

(6)吸去上清，加入1mL Accutase吹打2-3次，于37℃消化5min。

(7)消化完成后吹打4-5次，加入1mL DMEM/F12，继续吹打4-5次。

(8)300g离心5min，吸去上清。

(9)解冻的基质胶和细胞悬液放在冰盒上，用预冷枪头吸取180μL基质胶，与细胞悬液混匀，注意避免产生气泡。

(10)使用预冷枪头，按每孔30μL将含细胞的基质胶种到24孔板上，缓慢打入混合液时，逐渐向上移动枪头，使细胞均匀分布在胶中。

(11)将培养板放在培养箱中，20-30min，使胶滴凝固;

(12)小心沿孔壁加入500μL恢复室温的胰腺(3D)类器官成熟培养基，每隔1天换液。

(13)至D28，胰腺类器官成熟，即可进行鉴定和相关实验。

流程图及参考图片