hiPSC诱导分化肾类器官试剂盒

产品介绍

本产品为iPSC诱导分化肾类器官试剂盒，人诱导多能干细胞hiPSC通过该试剂盒诱导分化可得到肾类器官，该类器官具类似肾的细胞组成，有肾小球、肾小管上皮细胞等。
本试剂盒需要操作人员具有hiPSC培养经验，对类器官具有一定了解。
注意：本产品仅提供给进一步科研使用，不可用于临床治疗等其他用途。

hiPSC诱导分化肾类器官试剂盒

实验仪器、材料

仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱
材料：6孔细胞培养板、超低吸附96孔板、离心管（规格为15 mL 和 50 mL）、移液器（规格为 10 μL、100 μL、1000 μL和多通道100 μL）、无菌吸头（规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（规格为10 mL、50 mL）

操作步骤

一、EB形成（2天）
1. hiPSC于VTN包被的六孔板的一个孔生长至70-80%汇合度。
2. 吸去培养基。
3. 孔中加入1 mL PBS（无钙镁离子）洗，吸去。
4. 孔中加入1 mL Tryple express，37℃消化5min。
5. 于两只15 mL 离心管中分别加入10 mL EB形成培养基，并补充10 uM Y27632。（注意：所用培养基均应提前在工作台放置30min以恢复室温，后面操作同理。）
6. 消化完成后于显微镜下可看到克隆发白发亮。
7. 吸去Tryple express，每孔加入1 mL EB形成培养基终止消化。
8. 轻轻吹打孔内细胞2-3次，将细胞悬液移至有9 mL EB形成培养基的15 mL离心管中。
9. 100g离心5min，吸弃上清。
10. 向细胞沉淀加入10 mL 步骤5获得含Y27632的EB形成培养基，重新制成细胞悬液。
11. 将细胞悬液移至加样槽，使用多通道移液器种到超低吸附96板中，每孔100 μL，接种96个孔，普通96孔板每孔加100 μL PBS，96孔作为配平。
12. 于低速水平离心机，850rpm/120g离心3min，将板放入37℃，5%CO2的培养箱，记为D-2。
13. 第2天(D-1）可以看到形成大小均一的EB。每孔补充100 μL不含Y27632的EB形成培养基，放入37℃，5%CO2的培养箱。
（注意：补充EB形成培养基后，可将多通道移液器枪头置于液面下轻轻吹打，在不影响到EB的情况下混匀培养基。）
二、后原始条纹诱导（4天）
14. D0，解冻补充剂A，将基础培养基1与补充剂A混匀，作为后原始条纹诱导培养基。
15. 准备15 mL离心管，使用100 μL移液枪将孔中原培养基吸出放至离心管中。
16. 取出10 mL配好的后原始条纹诱导培养基，使用移液器移至加样槽中，使用多通道移液器，每孔加100 μL后原始条纹诱导培养基，放入37℃，5%CO2的培养箱继续培养。
（注意：吸去培养基时废液泵吸力过大，往往会将EB一并吸走，故采用100 μL移液枪逐孔吸取废液。）
17. D2更换后原始条纹诱导培养基，操作如15、16。
三、中间中胚层诱导（3天）
18. D4，解冻补充剂B，将基础培养基2与补充剂B混匀，作为中间中胚层诱导培养基。更换中间中胚层诱导培养基，操作如15、16。
19. D6更换中间中胚层诱导培养基，操作如15、16。
四、肾发生（5天）
20. D7，解冻补充剂C、D，将10 mL基础培养基3与补充剂C混匀，作为肾发生培养基1。更换肾发生培养基1，操作如15、16，放入37℃，5%CO2的培养箱培养1小时。
21. 1小时后，将30 mL基础培养基3与补充剂D混匀，作为肾发生培养基2。更换肾发生培养基2，操作如15、16。
22. D9、D11，更换肾发生培养基2，操作如15、16。
四、肾类器官成熟（11天）
23. D12开始，每2天更换成熟培养基，操作如15、16，至D23。

流程图及参考图片