hiPSC诱导分化胰岛类器官试剂盒

产品描述

本试剂盒专为人多能干细胞高效定向分化为胰岛类器官而设计，提供标准化、无血清、化学成分明确的培养体系，适用于疾病模型构建、药物筛选及细胞治疗研究，获得的胰岛类器官能表达α细胞、β细胞、δ细胞特异性标志物(如 GCG、C-peptide、SST等)，适用于体外研究。

本产品要求操作人员具有3D悬浮培养细胞经验及常识。

以6孔板为例，本产品提供的规格可供至少6个孔的类器官诱导分化，根据分化方法，每孔可最终获得20-100或400-1000个类器官。

本产品分化流程图

hPSC(human pluripotent stem cell)：人多能干细胞;DE(definitive endoderm)：内胚层;GTE(gut tube endoderm)：肠管内胚层;PE(pancreatic endoderm)：胰腺内胚层;PP(pancreatic progenitors)：胰腺祖细胞;EP(endocrine progenitors)：内分泌祖细胞;IO(islet organoid)：胰岛类器官

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如25×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂S1a(25×)需添加进基础培养基1-2使其稀释25倍，使得补充剂S1a终浓度为1×，配成诱导培养基S1a。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻 补充剂，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如诱导培养基S1a组成为基础培养基1-2、1×浓度的补充剂S1a，若用量为8mL，配制方法为7.68 mL基础培养基1-2 + 0.32 mL补充剂S1a(25×)。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、DAY 0-4:第一阶段

(1) 基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合(基质胶:DMEM/F12=1:100)，铺板，备用。

(2) DAY -1: 当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。

(3) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。

(4) 3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5) 从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。

(6) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的hESC/iPSC 完全培养基(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(7) 按0.313-0.521×10⁶个细胞/cm2比例将细胞接种到步骤1制备的基质胶包被的板上，在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。

(8) DAY 0: 24h后吸去培养基(密度应为100%)，并加入2mL 诱导培养基S1a(成分为：基础培养基1-2，1×补充剂S1a)培养24h。

(9) DAY 1: 24h后吸去培养基，使用诱导培养基S1b(成分为：基础培养基1-2，1×补充剂S1b)换液，直到第4天，期间根据培养基颜色每天或隔天换液。

注：基质胶使用时需在冰上操作，所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷，基质胶超过10℃将迅速凝固，导致铺板失败。

三、DAY 4-7:第二阶段

(1) DAY 4： 第4天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。使用2mL预热的诱导培养基S2(成分为：基础培养基1-2，1×补充剂S2)换液。

(2) 根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基S2换液，直到第7天。

四、DAY 7-10:第三阶段

(1) DAY 7: 第7天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。使用2mL预热的诱导培养基S3(成分为：基础培养基3-4，1×补充剂S3)换液。

(2) 根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基S3换液，直到第10天。

五、DAY 10-14: 第四阶段

(1) DAY 10: 第10天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。使用2mL预热的诱导培养基S4(成分为：基础培养基3-4，1×补充剂S4)换液。

(2) 根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基S4换液，直到第14天。

六、DAY 14-21: 第五阶段

(1) DAY 14: 第14天，弃去培养基，每孔加入1 mL TrypLE于培养箱消化3-10分钟。之后使用1 mL DMEM培养基中止消化，吹下并转移至15mL离心管于300g离心3min。弃上清，使用诱导培养基S4(含10uM Y27632)重悬。按4-8×105个细胞/孔的密度接种于垫有细胞培养片(细胞培养片使用方法参照该产品说明书)的24孔板内培养24h，使其形成100-200 um左右的细胞球。

(2) DAY 15: 24h后，使用旧培养基对细胞球轻轻吹打悬浮，吸取细胞球悬浮液于15mL离心管100g离心3min，弃去上清，使用诱导培养基S5(成分为：基础培养基5，1×补充剂S5)重悬，转移至低吸附六孔板中(每2细胞培养片的细胞球收集于六孔板1孔中)，并添加培养基至2 mL。根据培养基颜色隔1-2天使用诱导培养基S5换液，直到第21天。

注：①细胞铺板密度需根据细胞状态与细胞株确定，根据经验一般为6×105个细胞/孔。

②若不想用细胞培养片，可按1：2比例使用诱导培养基S4(含10uM Y27632)直接传代于低吸附6孔板中培养24h，24 h后换成2 mL诱导培养基S5(若形成较大的细胞团，可吹散成小块)，根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基S5换液，直到第6天。

③细胞培养片可用微孔数相差不大的24孔微孔板代替，原则上需确保每微孔有1000-2000个细胞。

④因为诱导培养基S5和S6中添加有防止细胞球粘连的成分，换液时需额外添加至少4倍于旧培养基体积的DMEM进行稀释后300g离心3-5min，弃去上清后换液，后续换液操作相同。

七、DAY 21-28: 第六阶段

(1) DAY 21: 第21天，使用2mL预热的诱导培养基S6(成分为：基础培养基6，1×补充剂S6)换液，根据培养基颜色隔1-2天使用诱导培养基S6换液，直到第28天。后续可继续维持培养至少7天。

(2) DAY 28: 可取第28天的类器官检测胰岛α细胞、β细胞、δ细胞特异性标志物(如GCG、 INS、C-peptide、NKX6.1、SST等)。

注：①第一次分化建议在12孔板分化，以熟悉分化流程与条件。

②不同细胞株分化效率不同，若持续分化失败，请更换细胞株。