hiPSC诱导分化内耳类器官试剂盒

产品介绍

本产品为iPSC诱导分化内耳类器官试剂盒，人诱导多能干细胞hiPSC通过该试剂盒诱导分化可得到内耳类器官，该类器官具类似内耳的细胞组成，生长过程中有分化出耳泡结构及毛细胞。
本试剂盒需要操作人员具有hiPSC培养经验，对类器官具有一定了解。
注意：本产品仅提供给进一步科研使用，不可用于临床治疗等其他用途。

hiPSC诱导分化内耳类器官试剂盒

实验仪器、材料

仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱
材料：6孔细胞培养板、超低吸附96孔板、离心管（规格为15 mL 和 50 mL）、移液器（规格为 10 μL、100 μL、1000 μL 和多通道100 μL）、无菌吸头（规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（规格为10 mL、50 mL）。

操作步骤

一、EB形成（2天）
1. hiPSC于VTN包被的六孔板的一个孔生长至70-80%汇合度。
2. 吸去培养基。
3. 孔中加入1mL PBS（无钙镁离子）洗，吸去。
4. 孔中加入1mLTryple express，37℃消化5min。
5. 于两只15mL 离心管中分别加入10ml EB形成培养基，并补充10 uM Y27632。（注意：所用培养基均应提前在工作 台放置30min以恢复室温，后面操作同理。）
6. 消化完成后于显微镜下可看到克隆发白发亮。
7. 吸去Tryple express，每孔加入1ml EB形成培养基终止消化。
8. 轻轻吹打孔内细胞2-3次，将细胞悬液移至有9ml EB形成培养基的15ml离心管中。
9. 100g离心5min，吸弃上清。
10. 向细胞沉淀加入10 mL步骤5获得含Y27632的EB形成培养基，重新制成细胞悬液。
11. 将细胞悬液移至加样槽，使用多通道移液器种到超低吸附96板中，每孔100 μL，接种96个孔，普通96孔板每孔加100 μL PBS，96孔作为配平。
12. 于低速水平离心机，850rpm/120g离心3min，将板放入37℃，5%CO2的培养箱，记为D-2。
13. 第2天(D-1）可以看到形成大小均一的EB。每孔补充100 μL不含Y27632的EB形成培养基，放入37℃，5%CO2的培养箱。
（注意：补充EB形成培养基后，可将多通道移液器枪头置于液面下轻轻吹打，在不影响到EB的情况下混匀培养基。）二、EB分化阶段（12天）
14. D0，解冻补充剂A，吸弃培养基，9.6 mL预冷的基础培养基1与补充剂A、200 μL Matrigel混合均匀，恢复至室温后，按每孔100 μL，加到96孔板中，诱导EB分化，用多通道移液器轻轻吹打，使EB悬浮。在37℃，5%CO2培养箱中培养4天。
15. D4，解冻补充剂B，2.5 mL基础培养基1+补充剂B混合均匀，按每孔25 μL，加到96孔板中，并轻轻移液8-10次混匀，使每孔培养基的终体积为125 μL，将96孔板放回培养箱，37℃，5%CO2培养4天。
16. D8，解冻补充剂C，2.5 mL基础培养基1+补充剂C混合均匀，按每孔25 μL，加到96孔板中，并轻轻移液8-10次混匀，使每孔培养基的终体积为150 μL，将96孔板放回培养箱，37℃，5%CO2培养4天。
三、耳泡形成阶段（6天）
17. D12，EB诱导结束，准备好基础培养基2（提前在冰上冷藏至少30min）；或者，在d11上使基础培养基2存储在4°C过夜。Matrigel提前与补充剂D于4℃解冻，冷的基础培养基2与补充剂D混合均匀。将200 μL Matrigel加入20 mL冷的混合培养基中，反复吹打溶解20次，复温到室温。将96孔板中的聚集物转移到两个100mm培养皿中，每个培养皿中有48个聚集体。用1-2 mL的DPBS洗涤聚集体2次，再用1 mL不含Matrigel的混合培养基洗涤1次，然后分别加入10 mL含Matrigel的混合培养基，将培养皿放入培养箱中，37℃，5%CO2 培养3天；D15吸掉培养皿中的培养基，重新加入不含Matrigel的混合培养基，继续培养3天，诱导耳泡形成；
（注意：10 mm皿一般换液需要10 mL培养基）
四、内耳类器官成熟阶段（42天）
18，D18-60，内耳类器官逐渐成熟，将培养基换成成熟培养基，开始长期培养，每5天换一次液，到60天左右获得具有感觉毛细胞的成熟内耳类器官。

流程图及参考图片