hiPSC诱导分化肺类器官iHLOs

产品介绍

本产品iHLOs 为 hiPSC诱导分化肺类器官，该类器官由类似肺泡的细胞组成，成熟后的类器官有气道细胞、肺泡细胞。在体外培养条件下可维持60天，并稳定传代扩增、冻存和复苏。
本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对类器官具有一定了解。
注意：本产品仅提供给进一步科研使用，不可用于临床治疗等其他用途。

hiPSC诱导分化肝类器官iHHOs

实验仪器、材料

仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱、恒温水浴锅。
材料：24孔细胞培养板、离心管（规格为15 mL 和 50 mL）、移液器（规格为 10 μL、100 μL、1000 μL）、无菌吸头（规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（规格为10mL、50mL）。

鉴定结果

操作步骤

一、iHLOs复苏
1. 基质胶在4℃下解冻，恒温水浴锅37℃预热，100 μL枪头于-20℃预冷，199.48 mL iHLOs基础培养基与520 μL  iHLOs培养补充剂混匀制备iHLOs完全培养基。（ 注意：配制iHLOs完全培养基需在2周内用完，可将iHLOs培养补充剂分装冻存，根据实验需要配制iHLOs完全培养基，避免反复冻融 ）。
2. 将含hiPSC诱导分化肺类器官 iHLOs的冻存管从液氮罐中取出，在37℃水浴锅中快速解冻，当剩少许浮冰时，取出，酒精消毒，转移到生物安全柜中。
3. 将解冻好的细胞悬液转移到15离心管中，缓慢加入9 mL复温的DMEM/F12（含10μM Y27632），150g离心5min。 
4. 去上清，加入30 μL基质胶，均匀混合基质胶-单细胞，用预冷枪头将30 μL基质胶加到孔中心，然后转移到培养箱中，20-30min，使胶滴凝固。
5. 取出培养板，小心沿孔壁加入恢复室温的700μL iHLOs完全培养基，注意不要碰到胶滴。注意：所用试剂除标注“预冷”外，在使用前均需恢复至室温。
6. 将孔板放到培养箱中，继续培养，每两天更换iHLOs完全培养基，每7-10天传代。
二、iHLOs传代
1. 取出冷冻的基质胶置于4℃解冻，并提前将枪头放置在-20℃预冷1h。
2. 吸除培养基，加入1 mL预冷的Tryple（含1%BSA），静置1 min。
3. 使用1 mL移液枪，吹打孔中混合物40-50次。注意：不要产生气泡。
4. 每孔加入1 mL预冷的PBS（含1%BSA），将混合物转移到15 mL离心管中；
5. 用1 mL预冷的PBS（含1%BSA）清洗培养板，并将该清洗液加入上一步的离心管中，并补充预冷的PBS（含1%BSA），使离心管中的终体积为12 mL； 300 g离心5min，去上清。
6. 用预冷枪头按每孔30 μL的量在离心管中加入适量的基质胶，吹打5-8次，均匀混合单细胞-基质胶，注意吹打过程中避免产生气泡。
7. 在24孔板孔中心位置加入30 μL胶滴，缓慢打入混合液时，逐渐向上移动枪头，使细胞均匀分布在胶中。
8. 将培养板放在培养箱中，20-30min，使胶滴凝固。
9. 小心沿孔壁加入700 μL恢复室温的iHLOs完全培养基，每隔1天换液一次（可周一、周三、周五换液，周五可添加至800 μL，周六、周日不换液），注意不要碰到胶滴，将孔板放到培养箱中，继续培养。
三、 iHLOs冻存
1. 将程序降温盒放在-20℃中预冷1h。
2. 吸除培养基，加入1 mL预冷的Tryple（含1%BSA），静置1min。
3. 使用1 mL移液枪，吹打孔中混合物40-50次，注意：不要产生气泡。
4. 每孔加入1 mL预冷的DMEM/F12（含1%BSA），将混合物转移到15 mL离心管中。
5. 用1 mL预冷的DMEM/F12（含1%BSA）清洗培养板，并将该清洗液加入上一步的离心管中，并补充预冷的DMEM/F12（含1%BSA），使离心管中的终体积为12 mL。
6. 300 g离心5min，去上清。
7. 加入1 mL预冷的类器官冻存液（含10 μM Y27632），重悬细胞，并转移到冻存管中。
8. 将冻存管放到提前预冷的降温盒中，将降温盒转移到-80℃冰箱，过夜；隔天将降温盒里的冻存管转移到液氮罐中，长期保存。