hPSC诱导分化血管类器官试剂盒

产品描述

本产品为 hPSC 诱导分化血管类器官试剂盒，人多能干细胞 hPSC 通过该试剂盒诱导分化可得到血管类器官，该类器官由内皮细胞、周细胞等细胞组成，成熟后的类器官有血管网络状结构。

本试剂盒需要操作人员具有 hPSC 培养经验，对类器官具有一定了解。

使用超低吸附 96 孔板，可诱导 2 板 192 个血管类器官，成功率 70-80% 。

本产品分化流程图

实验仪器、材料

仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱

材料：超低吸附细胞培养板(规格为：6孔平底、96 孔圆底)、细胞培养板(规格为：12孔)、离心管(规格为 15 mL 、50 mL)、移液器(规格为 10 μL 、100 μL 、1000 μL)、无菌吸头(规格为 10 μL 、200 μL 和 1000 μL)、 移液管(规格为 10 mL 、50 mL)

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

其他推荐试剂

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法

1、Ⅰ阶段(D-1)(按6孔板3孔计算)

(1)将基础培养基1与补充剂A充分混合后按需分装保存。

(2)hPSC 于基质胶包被的六孔板的一个孔生长至70-80%汇合度，吸去培养基。

(3)孔中加入 1mL PBS(无钙镁离子)洗，吸去。

(4)孔中加入 1mL Accutase ，37℃消化 5 min。

(5)消化完成后于显微镜下可看到克隆发白发亮。轻拍孔板侧边几下，使细胞脱离板底，加 入 1mL hESC/iPSC 完全培养基(IMC-014)或等体积的干细胞培养基终止消化，并使用 P-1000 吸头将这 2mL 细胞单悬液收集到 15mL 离心管中，室温下 300 g 离心 5 min。

(6)离心结束，去除上清至剩 20ul ，轻弹管底 3-4 下，加入1mL配好的Ⅰ阶段培养基重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(7)使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞 ，按每孔2x10^5 个细胞的比例 计算好所需细胞量，按每孔 3ml 培养基的量加入Ⅰ阶段培养基补充至9mL，将细胞吹打均匀，然后按每孔 3 mL 将细胞悬液接种到超低吸附6孔板中，然后将孔板转移到 37℃ 、5%CO2 细胞培养箱中孵育0-3天，直到形成边缘光滑(直径50至100μM)的细胞聚集体(EB)。

注：不同来源细胞培养细胞聚集体(EB)时间不一，如下从EB分化中胚层开始计算诱导周期。

2 、Ⅱ阶段(D0-2)

(1)将基础培养基2、补充剂B和C充分混合后按需分装保存。

(2)在聚集体形成后的第二天(D0)，将EB转移到15mL离心管中，等待聚集体通过重力稳定下来。

(3)当EB沉降在离心管底部后，小心的吸掉上层培养基，缓慢加入9mLⅡ阶段培养基，轻轻吹打使EB重悬在培养基中。

(4)按每孔3mL将EB和培养基转移到6孔板中，然后将孔板转移到 37℃ 、5%CO2 细胞培养箱中孵育3d天。

(5)每隔1天换一次培养基，每天轻轻吹打7-8次EB，使EB重新悬浮，避免EB间过度融合。

3 、Ⅲ阶段(D3-4)

(1)将基础培养基3、补充剂D和E充分混合后按需分装保存。

(2)第 3 天，将EB转移到15mL离心管中，等待聚集体通过重力稳定下来。

(3)当EB沉降在离心管底部后，小心的吸掉上层培养基，缓慢加入9mLⅢ阶段培养基，轻轻吹打使EB重悬在培养基中。

(4)按每孔3mL将EB和培养基转移到6孔板中，然后将孔板转移到 37℃ 、5%CO2 细胞培养箱中孵育2天。

4 、Ⅳ阶段(D5-40)(按12孔板10孔计算)

(5)提前吸出26mL基础培养基4分装备用，将剩下的基础培养基4、补充剂F和G充分混合后按需分装保存;补充剂H在4℃过夜解冻，按需分装后，保存在-20℃中，避免反复冻融，补充剂H的分装和使用要在冰上操作。

(6)取1块12孔板，每孔加入500μL补充剂H，将孔板转移到培养箱中，静置孵育1-2h使孔里的补充剂凝固。

(7)将EB转移到15mL离心管中，等待聚集体通过重力稳定下来。当EB沉降在离心管底部后，小心的吸掉上层培养基，加入1mL基础培养基4吹洗一遍EB，按每孔40-60个EB的量取出所需数量，小心的吸掉培养基。

(8)按每孔500μL在算好的EB里加入补充剂H，轻轻吹打使EB重悬在补充剂H中，吹打过程中尽量轻柔，避免吹出气泡。

(9)从培养箱中取出12孔板，在包被了补充剂H的孔中小心的加入500μLEB-补充剂H混合液，8字摇晃几次使EB均匀的分布在孔中，将孔板转移到培养箱中孵育1-2h使孔里的补充剂凝固。注意：摇板时间不要超过30S-1分钟，以免干扰凝固过程。

(10)等孔板里面的混合液凝固后，取出孔板每孔加入1mLⅣ阶段培养基，然后将孔板转移到 37℃ 、5%CO2 细胞培养箱中继续培养。

(11)在第8-10天可观察到血管网络的生成，D10可以取样固定检测。

(12)第10天，用无菌细胞铲使凝胶脱离孔板，在无菌操作下使用无菌针头分离出单个血管网络，将分离的单个血管网络转移到超低吸附6孔板中，每孔加入5mLⅣ阶段培养基，培养1d。

(13)第11天，将单个血管网络转移到超低吸附圆底96孔板中，每孔加入100μLⅣ阶段培养基，将孔板转移到培养箱中进行长期培养，每隔1天更换培养基。

(14)第40天可取样检测。

注： 不同细胞株分化效率不同，若持续分化失败，请更换细胞株。