hiPSC诱导分化小肠类器官

1). 提前在室温下预热DMEM/F12。

2). 在 37℃的水浴中快速解冻细胞冻存管，当冻存管内冻存物仅剩些许冰渣残留时立即停止水浴并及时转移至洁净操作台。

3). 将细胞悬液转移至离心管中，缓缓加入5-10倍体积的DMEM/F12，轻轻混匀。

4). 200 g，离心3-5 min，弃上清。

5). 再次加入DMEM/F12重悬细胞沉淀，重复步骤4。

6). 弃上清后所获细胞沉淀按细胞传代：3).- 6).步骤用于后续类器官培养。

细胞传代

1). 吸除培养基，加入预冷的PBS或DMEM/F12溶解基质胶，将混合液转移到离心管中，多次吹打（5~10 次）使类器官与基质胶分离，300g离心 3min，去除上层的 PBS和基质胶。注：所有与类器官接触的耗材都需要用抗粘附液润洗1-2次，例如枪头与离心管等。

2). 加入 1mL 预冷的PBS或DMEM/F12，机械吹打使类器官变成小细胞团，300g 离心3min，去除上清;注：吹打后可以在镜下观察细胞团大小是否合适。

3). 用预冷枪头按每孔30-40μL 的量在离心管中加入适量的基质胶，在冰上快速、轻柔地混合均匀，注意吹打过程中避免产生气泡，此步骤应尽快完成，避免基质胶凝固;

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

4). 将提前放在培养箱中的24孔板取出,将细胞-基质胶混合液快速滴加至预热的培养板孔中央，滴加混合液时，逐渐向上移动枪头，使细胞均匀分布在胶中;

5). 将培养板放在培养箱中，正置孵育20-30min，使胶滴凝固；

6). 胶滴凝固后，沿孔壁缓慢加入预热好的hPSC小肠类器官成熟培养基。将培养板放回培养箱，定期（如每2-3天）更换培养基，并在显微镜下观察类器官的生长和形态。

1. 收到细胞后首先观察细胞冻存管是否完好，冻存液是否有解冻现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭冻存管表面，之后进行细胞复苏步骤。若暂不复苏，应立即将冻存管转移至液氮罐中长期保存。

4. 客户可购买hPSC诱导小肠类器官成熟培养基（货号IMV-A029）。

5. 建议客户复苏细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。

6.该细胞仅供科研使用。