胰腺祖细胞诱导分化胰岛类器官试剂盒

产品描述

本试剂盒专为胰腺祖细胞高效定向分化为胰岛类器官而设计，提供标准化、无血清、化学成分明确的培养体系，适用于疾病模型构建、药物筛选及细胞治疗研究，获得的胰岛类器官能表达α细胞、β细胞、δ细胞特异性标志物(如 GCG、C-peptide、SST等)，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对3D悬浮培养具有一定了解。

以6孔板为例，本产品提供的规格可供至少6个孔的类器官诱导分化，根据分化方法，每孔可最终获得20-100或400-1000个类器官。

本产品分化流程图

PP(pancreatic progenitors)：胰腺祖细胞;EP(endocrine progenitors)：内分泌祖细胞;IO(islet organoid)：胰岛类器官

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如36×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂S1(36×)需添加进基础培养基1使其稀释36倍，使得补充剂S1终浓度为1×，配成诱导培养基S1。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻 补充剂，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如诱导培养基S1组成为基础培养基1、1×浓度的补充剂S1，若用量为72 mL，配制方法为70 mL基础培养基1 +2 mL补充剂S1(36×)。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、胰腺祖细胞培养和准备(详见 胰腺祖细胞(PP)维持培养基使用说明书，cat: IMI-PP01M)

三、DAY 0-6: 第一阶段

(1) DAY -1: 第-1天，当PP达到100%密度时弃去培养基，每孔加入1 mL TrypLE于培养箱消化3-10分钟。之后使用1 mL DMEM培养基中止消化，吹下并转移至15mL离心管于300g离心3min。弃上清，使用胰腺祖细胞维持培养基(含10uM Y27632)重悬。按4-8×105个细胞/孔的密度接种于垫有细胞培养片(使用方法参考培养片产品说明书)的24孔板内培养24h，使其形成100-200 um左右的细胞球。

(2) DAY 0: 24h后，使用旧培养基对细胞球轻轻吹打悬浮，吸取细胞球悬浮液于15mL离心管100g离心3min，弃去上清，使用诱导培养基S1(成分为：基础培养基1，1×补充剂S1)重悬，转移至低吸附六孔板中(每2细胞培养片收集于六孔板1孔中)，并添加培养基至2 mL。根据培养基颜色隔1-2天使用诱导培养基S1换液，直到第6天。

注：①细胞铺板密度需根据细胞状态与细胞株确定，根据经验一般为6×105个细胞/孔。

②若不想用细胞培养片，可按1：2比例使用胰腺祖细胞维持培养基(含10uM Y27632)直接传代于低吸附6孔板中培养24h，24 h后换成2 mL诱导培养基S1(若形成较大的细胞团，可吹散成小块)，根据培养基颜色每天或隔天使用诱导培养基S1换液，直到第6天。

③细胞培养片可用微孔数相差不大的24孔微孔板代替，原则上需确保每微孔有1000-2000个细胞。

④因为诱导培养基S1和S2中添加有防止细胞球粘连的成分，换液时需额外添加至少4倍于旧培养基体积的DMEM进行稀释后300g离心3-5min，弃去上清后换液，后续换液操作相同。

四、DAY 6-13+: 第二阶段

(1) DAY 6: 第6天，使用2mL预热的诱导培养基S2(成分为：基础培养基2，1×补充剂S2)换液，根据培养基颜色隔1-2天使用诱导培养基S2换液，直到第13天。后续可继续维持培养至少7天。

(2) 可取第13天的类器官检测胰岛α细胞、β细胞、δ细胞特异性标志物(如GCG、 INS、C-peptide、NKX6.1、SST等)。

注：①第一次分化建议在低吸附12孔板分化(接种细胞球比例及培养基用量按底面积换算)，以熟悉分化流程与条件。

②不同细胞株分化效率不同，若持续分化失败，请更换细胞株。