胰腺祖细胞诱导分化胰腺类器官试剂盒

产品描述

本产品为胰腺祖细胞诱导分化胰腺类器官试剂盒，胰腺祖细胞通过该试剂盒诱导分化可得到胰腺类器官，成熟后的胰腺类器官有类似腺泡、导管的结构。

本产品需要操作人员具有hPSC细胞培养经验，对类器官具有一定了解。

规格数量

试剂盒最终可获得72个胰腺类器官的基质胶滴。试剂盒最多可以培养108个胶滴，每个胶滴约40个类器官。

实验仪器、材料

仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱

材料：TC处理的细胞培养板(规格为：6孔、12孔、24孔)、离心管(规格为15 mL 和 50 mL)、移液器(规格为 10 μL、100 μL、1000 μL)、无菌吸头(规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL)、移液管(规格为10mL、50mL)

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

注：括号内容如25×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂S1a(25×)需添加进基础培养基1-2使其稀释25倍，使得补充剂S1a终浓度为1×，配成诱导培养基S1a。

实验试剂与材料

表2. 推荐试剂&材料

实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)

一、试剂准备

表3. 各阶段培养基成分

(1) 在 4℃解冻 补充剂，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如诱导培养基S1a组成为基础培养基1-2、1×浓度的补充剂S1a，若用量为12mL，配制方法为11.52 mL基础培养基1-2 + 0.48 mL补充剂S1a(25×)。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、hESC培养和准备(详见 hESC/iPSC细胞培养试剂盒使用说明书)

三、胰腺祖细胞的培养和准备(详见hPSC诱导分化胰腺祖细胞试剂盒说明书)

四、DAY 0-3: 第一阶段

(1)DAY 0： 第0天，当胰腺祖细胞的汇合度达到75%-85%，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。

(2)加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Tryple，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。

(3)3-5min后，将DMEM/F12以等体积直接加入Tryple中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(4)吸弃上清，将解冻的基质胶和细胞沉淀放在冰盒上，用预冷枪头吸取预冷的S1诱导培养基60ul(成分为：基础培养基1-2，1×补充剂S1a，1×补充剂S1b)，与细胞混匀，再用预冷枪头吸取180μL基质胶，与细胞液混匀，注意避免产生气泡。使用预冷枪头，按每孔40μL将含细胞的基质胶种到24孔板上，缓慢打入混合液时，逐渐向上移动枪头，使细胞均匀分布在胶中。

注：培养基与基质胶比例1:3，细胞从6孔板接种至24孔板传代比例1:6-1:9，上述为1:6。

(5)放进培养箱孵育30min，使胶滴凝固。

(6)小心沿孔壁，每孔加入500μL诱导培养基S1，每天换液。

五、DAY 4-7: 第二阶段

(1)DAY4：第4天，从培养物中抽吸培养基，使用500μL预热的诱导培养基S2(成分为：基础培养基1-2，1×补充剂S2a，1×补充剂S2b)换液。

(2) 每天使用诱导培养基S2换液，直到第7天。

六、DAY 8-11: 第三阶段

(1)DAY 8：第8天，从培养物中抽吸培养基，使用500μL预热的诱导培养基S3(成分为：基础培养基3-4，1×补充剂S3a，1×补充剂S3b)换液。

(2) 每天使用诱导培养基S3换液，直到第11天。

七、DAY 12-长期维持培养: 第四阶段

(1)DAY 12：第12天，从培养物中抽吸培养基，使用500μL预热的诱导培养基S4(成分为：基础培养基3-4，1×补充剂S4a，1×补充剂S4b)换液。

(2) 每天使用诱导培养基S4换液。至D15，胰腺类器官成熟，即可进行鉴定和相关实验。从第12天开始，一周后可传代，传代比例为1：6，可稳定传代超过6代。