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ATCC细胞培养
产品规格：100 mL
¥68
产品规格：100 mL
¥80
产品规格：50mL *10
¥3500
本产品为hPSC诱导分化体节类器官试剂盒，人多能干细胞hPSC通过该试剂盒诱导分化可得到体节类器官，该成熟类器官轴向延伸、细胞分裂、上皮化，重现人类体节形成和轴向发育的各个方面。
本试剂盒需要操作人员具有hPSC培养经验，对类器官具有一定了解。
仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱
材料：细胞培养板(规格为：96孔)、离心管(规格为15 mL、50 mL)、移液器(规格为 10 μL、100 μL、1000 μL)、无菌吸头(规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL)、移液管(规格为10mL、50mL)
使用96孔平底低附着板，可诱导5板体节类器官，体节类器官数量至少480个，诱导效率诱导效率在70-80%。
| 研究阶段 | 产品名称 | 产品规格 | 储存 |
| Ⅰ阶段(D-1-0) | 基础培养基1 | 20mL | -20℃，12个月 |
| 补充剂A | 50μL | -20℃，6个月 | |
| 补充剂B | 50μL | -20℃，6个月 | |
| Ⅱ阶段(D1-3) | 基础培养基2 | 200mL | -20℃，12个月 |
| 补充剂C | 200μL | -20℃，12个月 | |
| 补充剂D | 200μL | -20℃，12个月 | |
| Ⅲ阶段(D4-9) | 基础培养基3 | 50mL | -20℃，12个月 |
| 补充剂E | 5mL | -20℃，12个月 | |
| 补充剂F | 250μL | -20℃，12个月 |
推荐试剂&材料
| 试剂&材料 | 品牌（e.g.） | 货号（e.g.） |
| hESC/iPSC细胞培养试剂盒 | - | IMC-014 |
| hESC（H9） | - | IM-H522 |
| hESC/iPSC传代工作液 | - | IMC-014-E |
| Y-27632 | - | IMC-014-Y |
| DMEM/F12培养基 | - | IMC-205 |
| Matrigel | Corning | 354277 |
| Accutase | STEMCELL | 07920 |
| DPBS | - | IMC-409 |
| 6孔细胞培养板 | 硕华生物 | - |
| 96孔细胞培养板 | 青岛金典生化器材有限公司 | - |
| 15 mL/50 mL离心管 | 硕华生物 | - |
| 10 μL/200 μL/1000 μL无菌吸头 | 佳顺生物 | - |
| 10mL/50mL移液管 | NEST | - |
1、Ⅰ阶段(D-1-0)(按1个六孔板，每孔2mL算)
(1)hPSC于基质胶包被的六孔板的一个孔生长至70-80%汇合度。
(2)吸去培养基。
(3)将5mL基础培养基1、补充剂A和补充剂B充分混合(可培养六孔板2孔)，按每孔2mL的体积接种到六孔板中，然后将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育1天。
2、Ⅱ阶段(D1-3)(按1个96孔板，每孔100μL算)
(1)孵育24h后，吸去培养基。
(2)孔中加入1mL PBS(无钙镁离子)洗，吸去。
(3)孔中加入1mL Accutase，37℃消化3min。
(4)消化完成后于显微镜下可看到克隆发白发亮。轻拍孔板侧边几下，使细胞脱离板底，加入1mL 基础培养基1终止消化，并使用P-1000吸头将这2mL细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
(5)离心结束，去除上清至剩20ul，轻弹管底3-4下，将1 mL预热的基础培养基1(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(6)使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞 ，按每孔500个细胞的比例将所需细胞收集到离心管中，将10mL基础培养基2、补充剂C与补充剂D充分混合(可培养2个96孔板)，将上面计数所得的细胞悬液加入5mL的含补充剂C/D的基础培养基2中，将细胞吹打均匀，然后按每孔50μL/500个细胞的体积将细胞悬液接种到96孔低吸附U形板中，1000rpm离心5min，然后将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。
(7)24h后，每孔加入150μL基础培养基2，然后将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h后，再次把培养基换成150μL基础培养基2，接着再孵育24h。
3、Ⅲ阶段(D4-9)
(1)等聚集体开始长出小的轴突体后，取出补充剂E置于4℃解冻，将1mL补充剂E与50μL补充剂F加入10mL冷的基础培养基3中，反复吹打溶解20次。将培养基换成80μL/孔含补充剂E/F的基础培养基3，再将类器官和培养基转移到96孔平底低附着板中，将培养皿放入培养箱中，37℃，5%CO2 培养24-48h。
如何判断原代细胞衰老了
1.形态学的观察，细胞突起变大、或细胞扁平;2.β半乳糖苷染色判断细胞是否衰老;3.增殖速率明显下降;4.对相关的标志物进行检测。
如何确保分离的原代细胞的活性
1.组织离体时间不能太久;2.低温冰上分离，但也不能直接从-80℃冰箱上取出一块冰;3.无菌操作体系;4.消化酶的浓度和消化时间的把控。
原代细胞可以无限的增殖
与细胞系不同，原代细胞具有有限的扩增能力。建议尽早使用原代细胞进行实验以防止遗传漂移。此外，如果你正在使用一个增值困难的细胞类型，你应该密切监测细胞形态，因为少量混杂的细胞(如成纤维细胞)可能随着时间的推移，大量生长从而成为主要细胞。
如何让原代细胞一直保持增殖能力
原代细胞传代有限，可以通过构建永生化细胞株使其获得无限增殖的能力，即转变为永生化细胞系。
原代细胞一般第几代做实验比较好
5代以内，3代最好。有些细胞比如特殊，如神经元、巨噬为终末分化细胞，增殖能力很弱，建议客户收到细胞请镜下观察细胞生长状态后直接用于后续实验，不建议传代进行扩增培养和冻存。
原代细胞可以冻存吗？冻存复苏后活率差的原因是什么?
这取决于细胞的类型。一些细胞类型像神经细胞，神经胶质细胞和一些生长缓慢的上皮细胞，不推荐扩增培养和再次冻存。其它的细胞类型像成纤维细胞、星形细胞、肾系膜细胞、星形胶质细胞等等，可以扩增培养和再次冻存。然而，需要注意的是再次冻存的过程可能导致细胞生长性能的改变。冻存后复苏活率低需要考虑冻存前细胞活性，细胞量以及冻存体系，冻存体系是指用的含血清的冻存液，还是一步冻存液，不同冻存方法对应的操作方法不同需要注意。
通常我们不推荐重新冻存原代细胞，因为这可以促进细胞衰老和/或导致功能变化。原代细胞非常敏感，重新冻结可能导致细胞死亡或损伤。
贴壁的原代细胞很难消化是怎么回事
细胞初代培养时在细胞皿上培养的时间过长，解决方法可以将酶的浓度降低，37℃培养箱中延长消化时间，或者分步消化。
原代上皮细胞传代之后形态发生变化
上皮细胞，传代容易变形，上皮细胞传代后，不容易再次贴壁，这个时候可以使用代膜的培养瓶或者瓶子包被一下(基质胶，鼠尾胶原，多聚赖氨酸等)都可以，上皮细胞，传代非常有限， 且生长比较慢，一般建议尽快实验，不适合长时间去大量扩增培养。
因原代细胞体外传代有限，传代次数皆为大部分人使用后的平均数据，受操作手法，培养环境，培养条件等因素综合影响，建议收到后，尽快完成实验，不建议反复冻存一直传代扩增。
提取原代细胞经常发生污染可以怎样改善
首先要确保细胞分离实验室是否存在细菌污染，如果存在问题，需要将实验室进行消毒，培养箱灭菌，检查试剂耗材是否可用，第二个就是注意无菌操作，保证试剂、剪刀镊子等无菌，第三是可以在培养液中加抗生素，双抗、两性霉素等。
1.细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液，细胞未开封，如出现污染状况等，重发
2.客户操作造成细胞污染，细胞状态不好，非我司推荐细胞培养体系，未提供真实清晰的培养前3天的细胞状态照片，不重发
3.原代细胞不建议客户自行冻存，收货后及时传代并安排实验，超出代数的细胞可能出现突变、状态变差等现象导致细胞无法进一步传代或者进行实验，对于自行冻存的细胞一律不予免费售后
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