hPSC诱导分化体节类器官试剂盒

产品描述

本产品为hPSC诱导分化体节类器官试剂盒，人多能干细胞hPSC通过该试剂盒诱导分化可得到体节类器官，该成熟类器官轴向延伸、细胞分裂、上皮化，重现人类体节形成和轴向发育的各个方面。

本试剂盒需要操作人员具有hPSC培养经验，对类器官具有一定了解。

实验仪器、材料

仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱

材料：细胞培养板(规格为：96孔)、离心管(规格为15 mL、50 mL)、移液器(规格为 10 μL、100 μL、1000 μL)、无菌吸头(规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL)、移液管(规格为10mL、50mL)

规格数量

使用96孔平底低附着板，可诱导5板体节类器官，体节类器官数量至少480个，诱导效率诱导效率在70-80%。

实验试剂

其他相关试剂

推荐试剂&材料

实验内容与方法

1、Ⅰ阶段(D-1-0)(按1个六孔板，每孔2mL算)

(1)hPSC于基质胶包被的六孔板的一个孔生长至70-80%汇合度。

(2)吸去培养基。

(3)将5mL基础培养基1、补充剂A和补充剂B充分混合(可培养六孔板2孔)，按每孔2mL的体积接种到六孔板中，然后将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育1天。

2、Ⅱ阶段(D1-3)(按1个96孔板，每孔100μL算)

(1)孵育24h后，吸去培养基。

(2)孔中加入1mL PBS(无钙镁离子)洗，吸去。

(3)孔中加入1mL Accutase，37℃消化3min。

(4)消化完成后于显微镜下可看到克隆发白发亮。轻拍孔板侧边几下，使细胞脱离板底，加入1mL 基础培养基1终止消化，并使用P-1000吸头将这2mL细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

(5)离心结束，去除上清至剩20ul，轻弹管底3-4下，将1 mL预热的基础培养基1(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(6)使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞 ，按每孔500个细胞的比例将所需细胞收集到离心管中，将10mL基础培养基2、补充剂C与补充剂D充分混合(可培养2个96孔板)，将上面计数所得的细胞悬液加入5mL的含补充剂C/D的基础培养基2中，将细胞吹打均匀，然后按每孔50μL/500个细胞的体积将细胞悬液接种到96孔低吸附U形板中，1000rpm离心5min，然后将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。

(7)24h后，每孔加入150μL基础培养基2，然后将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h后，再次把培养基换成150μL基础培养基2，接着再孵育24h。

3、Ⅲ阶段(D4-9)

(1)等聚集体开始长出小的轴突体后，取出补充剂E置于4℃解冻，将1mL补充剂E与50μL补充剂F加入10mL冷的基础培养基3中，反复吹打溶解20次。将培养基换成80μL/孔含补充剂E/F的基础培养基3，再将类器官和培养基转移到96孔平底低附着板中，将培养皿放入培养箱中，37℃，5%CO2 培养24-48h。