hESC/iPSC传代工作液

产品介绍

干细胞传代无酶工作液（hESC/ iPSC Passage Solution）适用于无滋养层依赖的干细胞的传代培养，具有温和，高效，使用普遍的特点。

hESC/iPSC传代工作液使用

1. 传代条件：① 细胞汇合度达 85%左右（如图 1(C-D)所示），一般情况下每 3-4 天传代；

② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。

注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过 5 天。

2. 传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按 1:5~1:12 的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度 85%，大小均匀（如图 1(C-D)所示），建议按照 1:8 进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。

注：1:8 传代就是 1 个孔瓶传 8 个孔（以 6 孔板为例）。

3. 将 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温（~25℃）。

4. 根据传代接种的孔数准备 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培养基，并按 1：4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C( IMC-014-Y） ，恢复至室温（~25℃）。

图 1.hESC/iPSC 完全培养基连续培养 hESC 细胞形态图 ：（A ）和（C ） 分别为 hESC 细胞培养第 2 和 4

天时 低倍镜 hESC 培养 形态图示， （B ）和（D ） 为培养至第 2 和 和 4 天时的 高倍镜 hESC 培养 形态图。

5. 将 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温（~25℃）。

6. 根据传代接种的孔数准备 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培养基，并按 1：4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（~25℃）。

7. 将孔内培养基吸取，加入 2 mL/孔的 DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃并吸取。

8. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution 使溶液完全覆盖孔底。

9. 置于 37℃培养箱中孵育 8-9 min。

注：① 消化 8-9 min 后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；

② 保持 6 孔板与培养箱金属隔板直接接触，使 6 孔板受热均匀，不要叠放。10. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及时加入 2 mL/孔预温的 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字摇晃 6 孔板使细胞脱离基质。

注：① 加 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 时，可轻柔吹打细胞 1-2 次，不能超过 2 次，避免反复吹打；有部分细胞（10%～15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间（< 10min）。

② hESC 不能长时间处于 hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过 4 孔（六孔板）。

图 2 ： 消化 hESC 细胞不同时间 形态图 ： （A ） 消化 8 min 低倍镜 hESC 培养的 的形态图; （B ） 消化 9 min

低倍镜 hESC 培养的 的形态图。

12. 吸取 6 孔板中的 Matrigel 溶液，加入预温的 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

13. 在 6 孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤 9 获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。

注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤 9 获得的细胞悬液收集至 2 mL 离心管，轻柔颠倒混匀细胞 1-2 次；再按照传代比例接种。

14. 接种后，水平十字摇匀 6 孔板三次，置于 37℃，5% CO 2 浓度，饱和湿度的培养箱中， 再次水平十字摇匀 6 孔板三次，培养过夜。

15. 18-24 小时后更换新 hESC/iPSC 完全培养基，此后每天换液，4-5 天后继续传代/冻存。