前列腺癌类器官完全培养基

产品描述

前列腺癌类器官完全培养基是一款用于维持培养及传代扩增前列腺癌组织来源类器官的完全培养基。该产品可以从前列腺癌组织快速生成前列腺癌类器官，极大程度维持了前列腺癌组织的特征，优化了实验步骤，提高类器官构建效率。

产品信息

表1. 产品规格

前列腺癌类器官完全培养基使用说明

1. 收到前列腺癌类器官完全培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻;

2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10 ml规格;

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。

注意：

l 分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期一年，注意避免反复冻融;

l 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用;

l 类器官培养基中内含有抗生素。

前列腺癌类器官的建立与传代培养

原代前列腺癌类器官的建立

注意：涉及人体生物样本的研究必须遵循所有相关的机构和政府法规。在收集人体生物样本之前，必须获得样本提供者的知情同意。

1. 将收集到的前列腺癌肿瘤组织浸泡于装有2-8℃类器官组织保存液的样本保存管中，样本转移运输过程中需全程保持2-8℃，尽量缩短运输时间。

2. 转移肿瘤组织至细胞培养皿中，使用无菌手术剪刀或手术刀和镊子尽可能多地去除脂肪、肌肉或坏死组织。

注意：移取组织、类器官前枪头、离心管等都应用类器官抗粘附液(IMV-A003)润洗，以减少类器官损失。后续不再特意注明。

3. 用2-8℃类器官专用基础培养基清洗组织反复涮洗约5 - 10次，洗去组织表面残渣。涮洗至清洗液澄清，去除清洗液。

4.在细胞培养皿中，使用无菌手术剪刀或手术刀将组织切碎成 3 mm3 的小块。

5.转移组织碎片至15 mL离心管中，加入10 mL组织消化液，37℃恒温振荡消化15-45 min，每10 min镜检观察，当出现大量细胞团块时，即可加入5% FBS终止消化。

6.使用70 μm 细胞筛网过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液于15 mL离心管中。

7.300 g，4℃，离心5 min，弃上清。

8.若细胞沉淀存在较大量红细胞，加入1-2 mL红细胞裂解液重悬细胞，冰上孵育3 min(或室温孵育3-5 min)，300 g，4℃，离心5 min，弃上清。若细胞沉淀无红细胞，可进入下一步。

9.重悬细胞沉淀于类器官基础培养基中，300 g，4℃，离心5 min，弃上清，清洗两次。

10.用前列腺癌类器官完全培养基和基质胶重悬细胞沉淀，混匀后分别取30-50 μL悬液接种于24孔板中，37℃、5% CO2培养箱中固胶15-30min。

注意：为防止基质胶凝固，全程在冰上操作，并尽快完成此过程。

基质胶浓度比例应>70%，过渡稀释不利于基质胶液滴的形成。

11.确认基质胶凝固后，沿孔壁小心加入500 μL/孔前列腺癌类器官完全培养基。在原代培养前四天可额外在培养基中添加Y27632(IMC-014-Y)提高类器官存活率，终浓度为10 uM。

注意：不要直接将培养基滴加到基质胶液滴上，以免破坏基质胶液滴形状。

12.将培养板置于 37°C和 5% CO2 的恒温培养箱中，每隔 3-4 天更换一次培养基。

13.密切监测类器官的生长状态，理想情况下，患者来源的前列腺癌类器官应在 7-10 天左右即可进行首次传代。

类器官的传代培养

1. 去胶：用经过类器官抗粘附液(IMV-A003)润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。 用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，多次吹打使得类器官与基质胶分离。

注意：移取类器官前枪头都应用类器官抗粘附液(IMV-A003)润洗，以减少类器官损失。后续不再特意注明。

2. 消化： 300 g 离心 3 min，弃上清，加入5～10倍体积的类器官传代消化液(IMV-A001)并充分混匀，37℃条件下消化孵育3～5 min至类器官分散。消化结束后加入适量类器官专用基础培养基(IMV-A010)中止消化。300 g 离心 3 min。

4. 清洗： 弃上清，加入 1 mL 类器官专用基础培养基(IMV-A010)重悬。300 g 离心 3 min。

5. 铺胶： 用适量类器官专用基础培养基(IMV-A010)重悬细胞沉淀(推荐加入10倍沉淀体积)，置于冰上预冷，加入适量基质胶(IMV-A017)混匀配置成70%胶浓度的细胞-培养基-基质胶混合液，点入24孔板底部正中央，每孔30-50 μL，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固;吹打时注意不要产生气泡。

6.凝胶：将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育15-30 min左右待基质胶凝固。

7.加入培养基：待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的前列腺癌类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL，避免破坏已凝固结构。

8. 将24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，每 3~4 天更换培养基，直到类器官需要进一步的实验。