人正常肠类器官（扩增）完全培养基

产品描述

人正常肠类器官(扩增)完全培养基(Human Intestines Organoid Medium)是一款适用于人正常肠类器官的原代培养和传代培养的完全培养基，可用于培养人小肠、人结肠等肠类器官的培养，培养成功率最高可达90%。该培养液能够实现肠正常上皮类器官的高效构建、传代和扩增，进行肠道相关疾病和囊性纤维化病(CF)、炎症性肠病、肠道损伤再生等研究。

产品信息

表1. 培养基组成信息

人正常肠类器官(扩增)完全培养基的制备

1. 收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻;

2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10ml规格;

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。

注意：

l 分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期一年，注意避免反复冻融;

l 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用;

l 类器官培养基中内含有抗生素。

人正常肠类器官的建立与传代培养

原代人正常肠类器官的建立

准备适量标准型基质胶于冰上解冻

注意：涉及人体生物样本的研究必须遵循所有相关的机构和政府法规。在收集人体生物样本之前，必须获得样本提供者的知情同意。

1. 将收集到的肠组织浸泡于装有2-8℃类器官组织保存液的样本保存管中，样本转移运输过程中需全程保持2-8℃，尽量缩短运输时间。

2.清洗：转移组织至细胞培养皿中，使用无菌手术剪刀或手术刀和镊子去除脂肪、肌肉或坏死组织等非上皮成分，用2-8℃类器官专用基础培养基清洗组织3次。将清洗后的肠组织剪碎至1 mm3 宽，转移至新的类器官专用基础培养基中，清洗多次，直至上清液澄清。

3.消化：加入10 mL 肠道消化液，置于37℃中消化 30 min左右，可用移液器轻柔吹打肠段，取上清显微镜下观察，待上清出现完整隐窝即可终止消化，若无隐窝可适当延长消化时间。

4.离心：消化完成后，300 g，离心5 min，弃去消化液。

5.重悬：加入类器官专用基础培养基，用 10 mL 移液管轻轻吹打、重悬组织碎片，吹打后的组织悬液进行 70 μm 滤网过滤。

6.收集：收集穿过滤网的组织悬液，300 g ，4℃，离心 3 min。

7.计数：弃上清，使用类器官专用基础培养基重悬组织沉淀，取 20 μL 悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300 g 离心力 4℃离心 3min，弃上清后置于冰上。

8. 用适量的基质胶重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每 10 μL基质胶悬液包含 70 至 100 个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

9. 将基质胶和组织细胞的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，每孔 30 μL 左右，避免悬液接触孔板侧壁。

10.将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

11.待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的人正常肠类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL，避免破坏已凝固结构。

12.将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。

13.每 2~3 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，人正常肠类器官应在5至7天内建成。

人正常肠类器官的传代培养

1. 待人正常肠类器官培养到直径为 200~500 μm 大小时(或变黑不再增大时)，即可进行传代(每代约10天左右)。用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将肠类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。

2.用经过润洗液润洗的枪头用力吹打重悬类器官悬浮液，多次吹打(5~10 次)使肠类器官与基质胶分离吹，300 g 离心 3 min。

3.弃上清，加入1mL类器官传代消化液重悬类器官沉淀，37℃二氧化碳培养箱消化3~10 min，每3 min取少量悬液镜检观察类器官状态，类器官已分散成碎片后机械吹打分散类器官后300g离心3 min。

4.弃上清，用类器官专用基础培养基清洗2 次。

5. 用适量的基质胶重悬清洗后的类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

6. 将基质胶和类器官的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔 30 μL 左右。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

7. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 15 min 左右待基质胶凝固后取出。

8. 待基质胶完全凝固后，沿孔壁加入提前预热的人正常肠类器官完全培养基，24孔板每孔 500 μL。

9. 将细胞培养板放入37℃培养箱中进行培养，密切观察人正常肠类器官的生长状态，每 3 天于倒置显微镜下拍照，记录多个视野中的类器官的形态和分布。