人肠类器官（扩增）原代分离培养套装

产品描述

人正常肠类器官(扩增)原代分离培养套装(Human Intestines Organoid Kit)是一款适用于人正常肠类器官的原代培养和传代培养的完全培养基，可用于培养人小肠、人结肠等肠类器官的培养，培养成功率最高可达90%。该培养液能够实现肠正常上皮类器官的高效构建、传代和扩增，进行肠道相关疾病和囊性纤维化病(CF)、炎症性肠病、肠道损伤再生等研究。。

产品信息

表1. 试剂盒

表2. 其他自备材料和试剂

人肠类器官完全培养基的制备

1. 收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻;

2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10 ml规格;

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。

注意：

l 分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期一年，注意避免反复冻融;

l 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用;

l 类器官培养基中内含有抗生素。

肠道消化液使用说明

1. 收到肠道消化液后，置于四度冰箱进行解冻;

2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10 ml规格;

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的消化液解冻后即可使用。

注意：配制后的肠道消化液可在 2-8℃ 储存，建议 24 h 内使用，或-20℃ 储存3个月。

类器官专用基础培养基使用说明

1. 可用于类器官原代建立时组织的清洗和消化后组织的重悬(建议加入1%双抗);

2. 可用于类器官复苏时的清洗，以去除残余冻存液;

3. 用于类器官传代、冻存时类器官的清洗;

4. 可以自行添加生长因子等成分配置成类器官完全培养基。

注意：

l 类器官专用基础培养基可在4℃冰箱中稳定保存，建议分装后使用;

l 本产品不含任何抗生素，如果需要请额外添加

人肠类器官的建立与传代培养

原代人肠类器官的建立

准备适量标准型基质胶于冰上解冻

注意：涉及人体生物样本的研究必须遵循所有相关的机构和政府法规。在收集人体生物样本之前，必须获得样本提供者的知情同意。

1. 将收集到的肠组织浸泡于装有2-8℃类器官组织保存液的样本保存管中，样本转移运输过程中需全程保持2-8℃，尽量缩短运输时间。

2.清洗：转移组织至细胞培养皿中，使用无菌手术剪刀或手术刀和镊子去除脂肪、肌肉或坏死组织等非上皮成分，用2-8℃类器官专用基础培养基清洗组织3次。将清洗后的肠组织剪碎至1mm3 宽，转移至新的类器官专用基础培养基中，清洗多次，直至上清液澄清。

3.消化：加入10 mL 肠道消化液，置于37℃中消化 30 min左右，可用移液器轻柔吹打肠段，取上清显微镜下观察，待上清出现完整隐窝即可终止消化，若无隐窝可适当延长消化时间。

4.离心：消化完成后，300 g，离心5 min，弃去消化液。

5.重悬：加入类器官专用基础培养基，用 10 mL 移液管轻轻吹打、重悬组织碎片，吹打后的组织悬液进行 70 μm 滤网过滤。

6.收集：收集穿过滤网的组织悬液，300 g，4℃，离心 3 min。

7.计数：弃上清，使用类器官专用基础培养基重悬组织沉淀，取 20 μL 悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300 g 离心力 4℃离心 3min，弃上清后置于冰上。

8. 用适量的基质胶重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每 10 μL基质胶悬液包含 70 至 100 个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

9. 将基质胶和组织细胞的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，每孔 30 μL 左右，避免悬液接触孔板侧壁。

10.将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

11.待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的人肠类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL，避免破坏已凝固结构。

12.将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。

13.每 2~3 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，人肠类器官应在5至7天内建成。

人肠类器官的传代培养

1. 待人肠类器官培养到直径为 200~500 μm 大小时(或变黑不再增大时)，即可进行人肠类器官的传代(每代约10天左右)。用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将肠类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。

2.用经过润洗液润洗的枪头用力吹打重悬类器官悬浮液，多次吹打(5~10 次)使肠类器官与基质胶分离吹，300 g 离心 3 min。

3. 弃上清，加入1mL类器官传代消化液重悬类器官沉淀，37℃二氧化碳培养箱消化3~10 min，每3 min取少量悬液镜检观察类器官状态，类器官已分散成碎片后机械吹打分散类器官后300g离心3 min。

4.弃上清，用类器官专用基础培养基清洗2 次。

5. 用适量的基质胶重悬清洗后的类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

6. 将基质胶和类器官的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔 30 μL 左右。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

7. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 15 min 左右待基质胶凝固后取出。

8. 待基质胶完全凝固后，沿孔壁加入提前预热的人肠类器官完全培养基，24孔板每孔 500 μL。

9. 将细胞培养板放入37℃培养箱中进行培养，密切观察人肠类器官的生长状态，每 3 天于倒置显微镜下拍照，记录多个视野中的人肠类器官的形态和分布。

类器官的冻存

1. 将消化完成后的细胞悬液，200 g ，离心5 min，弃去上清。

2. 用基础培养基清洗两次后，加入 4℃预冷的类器官冻存液，轻轻吹打混匀后迅速转移至细胞冻存管中(冻存管内细胞悬液体积应大于0.5 mL)。

注: 每1 mL 冻存液推荐冻存1×106个细胞或对应细胞量的类器官。

3. 将冻存管放入细胞冻存程序降温盒内(降温盒须提前平衡至室温)，随后立即将降温盒放入-80℃超低温冰箱中;也可将冻存管进行人工梯度降温处理，如 4℃ 静置 10 min，-20℃保存1小时，-80℃保存过夜。

4. 次日或 12 小时后将冻存管于-80℃超低温冰箱转移至液氮中长期保存。

类器官的复苏

1. 提前在 37℃条件下预热类器官专用基础培养基。

2.在 37℃的水浴中快速解冻细胞冻存管，当冻存管内冻存物仅剩些许冰渣残留时立即停止水浴并及时转移至洁净操作台。

3. 将细胞悬液转移至离心管中，缓缓加入5-10倍体积的类器官专用基础培养基，轻轻混匀。

4. 200 g，离心3-5 min，弃上清，再次加入类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀。

5.再次加入类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀，重复步骤4。

6.弃上清后所获细胞沉淀可用于后续类器官培养。