iFluor TM 488 标记鬼笔环肽（绿色）

产品描述

鬼笔环肽(Phalloidin)是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)的环状七肽毒素，以高亲和力(Kd=20nM)选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin，而不会与单体肌动蛋白G-actin结合，通常用来标记组织切片，细胞培养物或无细胞体系中的F-actin，从而对F-actin进行定性和定量分析。另外，鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维，无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞，按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。且非特异性结合几乎可忽略，染色区域和非染色区域辨识度非常明显。因此，鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白(Actin)抗体进行相关研究。另外鬼笔环肽衍生物很小，直径约12-15Å，分子量<2000Daltons，未标记肌动蛋白(Actin)的许多生理特性都得以维持，比如，同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能发生反应;鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质;以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。

鬼笔环肽(Phalloidin)的结合阻止丝状肌动蛋白(微丝)的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度(CC)降至<1µg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。此外，鬼笔环肽还可抑制F-actin的ATP水解活性。染色反应特异性强，对比性高，具有比Actin抗体更好的染色效果，适合用作F-actin的定性和定量检测。另外，经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛。

产品信息

表1.组成信息

产品优势

本品为iFluor TM 488荧光标记的鬼笔环肽，可发出高亮度、稳定荧光,染色反应特异性强,对比性高,适合用作F-actin的定性和定量检测。与Actin抗体比较, iFluor TM 488鬼笔环肽具有如下优点：

1、与actin亚单位一比一结合,并且不与G-actin结合,具有比Actin抗体更好的染色效果;

2、且本品的结合没有物种差异性,适用性广泛;

3、鬼笔环肽标记的非特异性信号可忽略,因而图像的反差较好;

4、染色与用于细胞分析的其他荧光染色完全兼容,包括荧光蛋白、Qdot纳米晶体和其他iFluor偶联物(包含iFluor偶联二抗);

5、经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。

使用说明

一、需要自备材料

1、1×PBS缓冲液, pH 7.4, 细胞培养级别

2、固定液(4%多聚甲醛溶于PBS缓冲液,pH 7.0)

3、破膜液(Triton X-100溶于PBS缓冲液0.5%)

4、BSA，标准级别

5、DAPI染液(即用型)

6、黑框/透明底的96孔细胞培养板

二、操作步骤

1、母液及工作液配制

母液准备：对于iFluor TM 488标记鬼笔环肽。本品以50ul/300ul形式提供，建议根据单次使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。4℃避光保存，3个月稳定。

工作液准备：开始实验前，使用1×PBS缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：1:40～1:200。工作液现配现用。按照1：200比例来计算，即1uL体积的iFluor TM 488标记鬼笔环肽溶液中加入200uL的1×PBS缓冲液浓度，可进行300次细胞染色。

【注】：稀释比可根据实际实验效果适当调整。

2、染色步骤

(1)细胞爬片生长24h，使其密度达到50%汇合度。

(2)吸掉培养液，37℃预热的1×PBS(pH 7.4)清洗细胞2次。

(3)使用溶于PBS的4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定10min。

【注】：避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。

(4)室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10min。

(5)室温条件下，用丙酮(≤-20℃)脱水或者用0.5% Triton X-100溶液透化处理5min。

(6)室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10min。

(7)取200µL配制好的iFluor TM 488标记鬼笔环肽工作液，覆盖住盖玻片上的细胞，室温避光孵育30min(通常情况下，4℃~37℃孵育皆可)。

【注】：为了降低背景，可于iFluor TM 488标记的鬼笔环肽工作液内加入1% BSA;另外，孵育过程中为了避免溶液挥发，可将盖玻片转移到一个密封的容器内。

(8)用PBS清洗盖玻片3次，每次5min。

(9)使用200µL DAPI溶液(浓度：100 nM)对细胞核进行复染，约30s。

(10)用PBS清洗盖玻片，然后倒置在已经滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封片剂，然后用指甲油永久封片。此法制备的标本玻片可置于4℃避光保存，通常6个月内可继续做F-actin染色分析。

(11)荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，选择iFluor 750激发/发射滤片(Ex/Em=750/777 nm)和DAPI激发/发射滤片(Ex/Em=364/454nm)。

注意事项

1、本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3、荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

4、鬼笔环肽具有毒性，需小心操作(对人的半数致死剂量LD50约2mg/kg)。