Calcein AM/ PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒

产品描述

Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光，其激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。因其在传统的Calcein(钙黄绿素)基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂(如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein, AM细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。

PI是一种 DNA 结合性染料，其激发和发射波长分别为 535nm 和 617nm，产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光。因此，PI仅对死细胞染色。

由于Calcein和PI都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545 nm激发，仅可观察到死细胞。

本染色方法适用于荧光显微镜、荧光酶标仪等微孔板荧光扫描设备、流式细胞仪或其他的荧光设备。本染色方法适用于大多数真核细胞，包括贴壁细胞和某些组织样本，但不包括细菌和酵母样本。

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

实验操作

1. 1×染色工作液的配制：

1) 将低温保存的Calcein-AM溶液和PI溶液回到室温20-30 min。

注：第一次使用可对母液进行分装，以减少反复冻融次数。

2) 取 20 µL Calcein-AM(1 mM)溶液和27 µL PI(1.5 mM)溶液加入5 mL 1×Assay Buffer，充分混匀后，得到Calcein-AM的工作液浓度为4μM，PI的工作液浓度为8μM。即1×染色工作液。

注：由于不同类器官的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定 Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。

2. 染色步骤：

以48孔板，每孔10 uL类器官基质胶胶滴为例，检测时只需弃除类器官培养液，保留孔板内10μL类器官基质胶凝聚物，加入染色工作液即可。

1) 吸弃类器官培养基，加入PBS清洗2-3次，以充分去除残留的酯酶酶活性。

2) 每孔加入250 μL混匀后的染色工作液，37℃孵育30～60 min。

3) 荧光显微镜下使用490±10 nm激发滤片同时检测活细胞(黄绿色荧光)以及死细胞(红色荧光)。另外，使用545 nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

注意事项

1. 由于Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。

2. 由于Calcein-AM的稳定性较差，此染色工作液必须现配现用，并且在当天完。

3. 荧光染料容易淬灭，染色完成后需要尽快进行检测。使用和保存时都需要注意避光。

4. 碘化丙啶(PI)有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清洗。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。