活性氧检测试剂盒(红色荧光)

产品简介

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟 化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。该活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen SpeciesAssay Kit)是一种以DHE为荧光探针，快速灵敏地检测细胞内超氧阴离子活性氧的试剂盒。

二氢乙锭DHE (Dihydroethidium)，可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙锭;氧化乙锭可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化。DHE 在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察。DHE本身固有的蓝色荧光，最大激发波长为 370 nm，最大发射波长为 420 nm;DHE 氧化脱氢后和 RNA 或 DNA 结合产生红色荧光，最大激发波长为 300 nm，最大发射波长为 610 nm，在实际观察时也可以使用 535 nm 作为激发波长。

本试剂盒只可以用于细胞的活性氧检测，本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。

本试剂盒可以测定100个/500个样品(96孔板)。

试剂盒组成

使用说明

贴壁细胞染色：

1、使用前用PBS或者无血清培养基稀释母液至所需工作浓度，通常5~20μM(按染色液：稀释液的比例为1：1000到1：250)就可以满足实验需求，具体的浓度要根据实验需要进行进一步的调整。

2、以96孔板为例，细胞量在每孔1×105~6时，加入的染色量200μL，工作液浓度在5~20μM，室温避光孵育60min或37℃孵育30~40min。

3、去除染色液，用1×PBS浸洗2次后，显微镜检测。

悬浮细胞染色：

1、收集悬浮细胞，离心弃掉培养基，用PBS/HBSS/HEPES缓冲液(不含酚红和钙镁)将细胞调整为1×105~6/mL的细胞悬液。

2、200μL的细胞悬液里面加入1~2μL的红色荧光染料原液(5mM)，吹打混合均匀，室温避光孵育60min或37℃孵育30~40min。

2、孵育后，250~500g离心5~10min，去除染色液，用PBS清洗2次，显微镜检测。

阳性对照：

阳性对照Rosup可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1mL,可以加入1μL 的阳性对照刺激。通常刺激后0.5~4h内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞， 活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后0.5h内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。

对于某些特别的细胞，实验过程中如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以 1:2500~1:1000稀释探针的终浓度为2~5μM。探针装载的时间也可以根据情况在15~60min内适当进行调整。

注意事项

1、实验前需戴好防护眼镜，穿戴防护服和口罩，佩戴手套，避免与皮肤接触。

2、荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

3、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

4、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。

5、有的细胞装载探针后细胞容易漂起来，洗细胞时实验组会吸走一部分细胞。所以种细胞时细胞量增加一倍，这样细胞紧密连接，贴壁比较牢，实验组的荧光值可能就会升高。另外有的细胞对探针很敏感，建议工作液浓度适当低到1~2μM，浓度太高容易有非特异性染色。

6、探针经稀释后很不稳定，一旦氧化，本底荧光值就会升高，工作液建议现用现配。

7、染⾊液为DMSO溶液，气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要充分融解后使用，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

8、结果处理，推荐表示细胞活性氧强度=荧光强度/蛋白(mg)，并且结合相关文献数据进行计算。

9、如果是流式检测，推荐贴壁细胞用胰酶消化制备成单细胞悬液;悬浮生长细胞，直接收集细胞。用PBS重悬细胞1×105~6/mL。

10、活性氧阳性对照(Rosup) 仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加⼊活性氧阳性对照。

11、定量的话要作标准曲线。先做一个推荐不同浓度H2O2(100~400μM)氧化荧光值，做一条标准曲线，X轴为H2O2浓度，Y轴是荧光值，得出一个方程，在看你样品的荧光值即Y值是多少，计算出对应的X值就是。

12、本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。