活性氧检测试剂盒

产品简介

活性氧检测试剂盒 (Reactive Oxygen Species Assay Kit with Diluent，也称ROS Assay Kit with Diluent)，是一种使用便捷、检测效果更有保障的提供了所需的稀释液，并利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物(compound mixture)，浓度为50mg/mL。本试剂盒同时提供了经优化的探针稀释液和Rosup稀释液，使用更便捷，通常可以确保获得更稳定可靠的检测效果。

本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。

本试剂盒小包装和中包装，6孔板每孔检测体系的体积为1mL时，分别可以检测100次和500次;96孔板每孔检测体系为100μL时，分别可以检测1000次和5000次。如果用于流式细胞仪，每个样品检测体系体积为0.5mL时，分别可以检测200次和1000次。

试剂盒组成

使用说明

1、装载探针

对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

注：活性氧阳性对照(Rosup)推荐使用本试剂盒提供的Rosup稀释液进行稀释，以确保获得良好的诱导效果。对于目的药物，也可以酌情使用Rosup稀释液进行稀释，以获得良好的诱导效果。

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000用探针稀释液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1mL。37℃细胞培养箱内孵育20min。用细胞外液(Extracellular Solution)或酌情使用PBS、HBSS、无血清细胞培养液等适当溶液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30min后可以显著提高活性氧水平。

收集细胞后装载探针：按照1:1000用探针稀释液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为1×106~2×107/mL，37℃细胞培养箱内孵育20min。每隔3-5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用细胞外液(Extracellular Solution)或酌情使用PBS、HBSS、无血清细胞培养液等适当溶液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30min后可以显著提高活性氧水平。

说明：仅在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。

2、检测

对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。

3、参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考图2。

图2：DCF的激发光谱和发射光谱

4、其它说明

阳性对照Rosup可以按照1:1000的比例用Rosup稀释液稀释后使用。例如装载好探针的细胞，直接吸除液体或离心后吸除液体，加入适当体积的按照1:1000稀释的Rosup阳性对照刺激。通常刺激后20-30min内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照(Rosup)的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30min内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照(Rosup)的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照(Rosup)的浓度。对于特定的细胞，Rosup作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行摸索最佳工作浓度和作用时间，甚至某些细胞可能对Rosup不敏感。

另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5μmol/L。

探针装载的时间也可以根据情况在15-60min内适当进行调整。

活性氧阳性对照(Rosup)仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照(Rosup)。

注意事项

1、实验前需戴好防护眼镜，穿戴防护服和口罩，佩戴手套，避免与皮肤接触。

2、荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光灭。

3、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

4、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF的激发光谱和发射光谱请参考使用说明中的图谱。

5、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。

6、荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用全黑96孔细胞培养板或黑色透明底96孔细胞培养板。

7、本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。