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ATCC细胞培养
产品货号：IMKO-H045
产品规格：1×106cells/T25或1mL冻存管
生长特性：悬浮生长
细胞形态：单核细胞
培养体系：90% 1640+10% FBS+PS+ 0.05 mM 2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)
价格：￥12000
产品规格：100mL
¥500
产品规格：100mL
¥98
产品规格：100mL
¥68
| 细胞基本属性 | |||||
| 产品名称 | NLRP1 knockout THP-1 cell line | ||||
| 产品货号 | IMKO-H045 | ||||
| 产品规格 | 1×106cells/T25或1mL冻存管 | ||||
| 储存及运输 | 干冰运输;储存在液氮中 | ||||
| 产品分类 | THP-1细胞 | ||||
| 物种 | 人 | ||||
| 修饰基因 | NLRP1 | ||||
| 修饰类型 | 基因敲除 | ||||
| 转导方法 | CRISPR/Cas9 | ||||
| 克隆类型 | 纯化克隆 | ||||
| 细胞鉴定 | 通过遗传学方法确认NLRP1基因敲除 | ||||
| 细胞形态 | 单核细胞 | ||||
| 生长特性 | 悬浮生长 | ||||
| 培养体系 | 90% 1640+10% FBS+PS+ 0.05 mM 2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol) | ||||
| 传代比例 | 1：2至1：3 | ||||
| 传代周期 | 每周3次 | ||||
| 培养条件 | 气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃ | ||||
| 冻存条件 | 无血清冻存液，液氮储存 | ||||
补充内容 | NLRP1（含NLR家族PYRIN域蛋白1）是NLR（核苷酸结合和寡聚化结构域）家族的一员，这个家族的蛋白质含有NLR结构域，可以识别病原体相关的分子模式（PAMPs），并触发炎症反应。NLRP1基因编码的蛋白质在免疫系统中起着重要作用，它可以通过与 other NLR家族成员和衔接蛋白ASC（凋亡小体相关蛋白）相互作用，来激活炎症小体（inflammasome）。 NLRP1炎症小体可以导致细胞死亡（pyroptosis）和炎症因子的释放，如白细胞介素（IL-1β和IL-18），从而在宿主防御中发挥作用。NLRP1基因的突变或表达改变与某些遗传性疾病和炎症性疾病有关。 | ||||
| 构建方法 |  | ||||
| NLRP1基因敲除细胞系构建通常涉及的步骤 | 1.设计敲除序列：研究人员需要设计特定的DNA序列，这些序列可以与NLRP1基因的靶位点结合，从而导致基因的敲除。这些序列通常是小向导RNA（sgRNA）的序列，它们可以与CRISPR/Cas9系统结合，引导Cas9酶切割目标基因。 2.表达载体：将设计的sgRNA序列和Cas9基因克隆到表达载体中，这个载体将被转染到目标细胞中。表达载体通常包含启动子、终止子以及筛选标记基因，以确保敲除基因后的筛选和稳定转染。 3.细胞转染：将构建的表达载体通过化学方法或病毒载体系统转入目标细胞中。转染后，细胞通常会被置于特定的培养条件下，以允许Cas9酶切割目标基因。 4.基因编辑：C9酶在sgRNA的引导下识别并切割目标基因，导致DNA断裂。细胞随后会通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）机制修复这些断裂。NHEJ是一种不完美的DNA修复机制，通常会导致基因敲除。 5.筛选和验证：转染后的细胞会被筛选，以确认是否成功敲除NLRP1基因。这通常通过PCR、测序或特定的分子标记来完成。筛选出的细胞会被扩大培养，以建立稳定的敲除细胞系。 6.功能分析：对敲除NLRP1基因的细胞进行功能分析，以评估基因敲除对细胞代谢、生长和分化的影响。这可能包括测定细胞内的炎症因子水平、细胞死亡方式以及细胞对特定刺激的反应等。 7. 稳定细胞系的建立：经过验证的敲除细胞会继续培养，以建立稳定的细胞系，这些细胞系可以在未来的研究中使用。 | ||||
| NLRP1基因的基本信息 | Species | Gene Symbol | Gene ID | GenBank Accession | Transcript |
Human (Homo sapiens) | NLRP1 | 22861 | NM_033004.4 | NP_127497.1 | |
| 关于基因 | Official Symbol | NLRP1 | |||
| Previous Symbol | NOD1L, NLRC4 | ||||
| Official Full Name | NOD-like receptor family, pyrin domain containing 1 | ||||
| Synonyms | NOD1L, NLRC4, PYD-containing protein 1, PYD1 | ||||
| Location | 17p13.2 | ||||
| Gene Type | Protein-coding | ||||
| Uniprot ID | E9PE50, I6L9D9, Q9BZZ8, Q9BZZ9, Q9C000, Q9H5Z7, Q9H5Z8, Q9HAV8, Q9UFT4, Q9Y2E0 | ||||
| Pathway/Library | Innate immune response, inflammasome | ||||
| Gene Summary | This gene encodes a member of the Ced-4 family of apoptosis proteins. Ced-family members contain a caspase recruitment domain (CARD) and are known to be key mediators of programmed cell death. The encoded protein contains a distinct N-terminal pyrin-like motif, which is possibly involved in protein-protein interactions. This protein interacts strongly with caspase 2 and weakly with caspase 9. Overexpression of this gene was demonstrated to induce apoptosis in cells. Multiple alternatively spliced transcript variants encoding distinct isoforms have been found for this gene, but the biological validity of some variants has not been determined. [provided by RefSeq, Jul 2008] | ||||
到货方式：复苏细胞/T25瓶运输
收货处理
1.收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，是否有破损、漏液、浑浊等现象。如果有，请立即和我们联系;如果没有，请您用75%酒精消毒细胞瓶外壁，再将其置于37度培养箱静置4h。细胞密度小于80%时，请换液并让细胞瓶处于透气状态(培养基不能回收使用)。
2.静置后观察细胞状态，在显微镜下确认细胞生长状态时，最好在低倍镜(4或5X物镜)下进行，能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X和20X物镜下，同时给刚收到的细胞拍照，(10×，20×)各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为细胞需要售后时提供收到细胞时细胞状态的依据。拍照反馈给我们。
3.静置后需镜下拍照(看整体密度)
a.如密度50%以下，建议换液并竖瓶培养
b.如密度50%-80%，建议换液培养，隔天观察密度
c.如密度90%，建议传代
4.换液及传代处理前，培养瓶竖着放置至少半小时(使细胞沉到瓶底);收集上清，必须将瓶内所有培养基(70ml)全部收集!并用PBS(10ml)润洗瓶底并收集!离心转速为1000rpm，5min。
传代密度：细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养
方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心3-5min分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。 方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
1.运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。
2.因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现象。请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。
3申请售后时请提供细胞收货时及反馈售后当天细胞清晰照片及培养信息，建议客户在细胞传代培养后，定期拍照、记录细胞生长状态。
4.所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
5. 细胞在不同实验室培养由于所使用培养基及血清品牌、个人操作习惯、培养瓶品牌等诸多培养条件不尽相同，导致细胞培养形态、生长速度、贴壁情况均可能有所差异，对于此类细胞适应环境生长的行为，不予过度解释或免费售后。
到货方式：冻存细胞/1ml冻存管运输
收货处理
1.干冰运输的细胞到货，请检查干冰是否完全挥发，细胞是否解冻，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2.为保证细胞的高存活率，收到产品后，请立即解冻复苏细胞，如若不能复苏请立即转入液氮冻存。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀
在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。
然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
冻存液配方：无血清冻存液，液氮储存
冻存密度
如果是有要求每管要冻多少细胞，那就用1ml完培重悬后，取部分按平时方法计数，剩下的细胞按计数需要的细胞量冻存即可。
如果没要求，那就按平时，一个皿冻一管。
待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例
1.收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，加1 mL血清重悬细胞，进行细胞计数。
2.根据细胞株数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5x10^6~1x10^7/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
冻存细胞转入液氮后及时复苏一管检查细胞冻存活性，若有异常，及时调整实验方案。
细胞培养时培养基是否需要预热
细胞培养时培养基需要预热。预热培养基可以减少环境的改变对细胞状态的影响，避免细胞因温度变化而产生应激反应，从而保持细胞的健康状态和生长环境的一致性。可以提前半小时左右，将培养基、PBS和胰酶在37°C下预热，把所需耗材和其他物品放置于超净工作台中紫外照射灭菌。
血清使用前需不需要灭活
一般培养细胞所使用的血清不需要灭活，灭活会导致血清部分营养损失、沉淀增多，灭活的优势(主要是灭活补体以免影响细胞生长)在实际培养过程中对于促进细胞生长并没有太大意义。部分细胞对于生长条件敏感，可以尝试灭活血清培养，但大部分细胞并不需要。
血清融化后有沉淀会影响细胞培养吗
血清沉淀主要是纤维蛋白等蛋白、磷酸盐、脂类等经冻融后析出，导致血清内出现沉淀现象，该现象与血清品质无关，大部分品牌的血清都会有这种情况，不会影响细胞培养，只是培养时可能偶尔观察到血清沉淀，注意区分血清沉淀和细胞污染即可。
细胞为何生长不均匀
细胞传代后放入培养箱没有摇匀，或者放入时摇匀，但在细胞贴壁前，又移动了培养瓶，频繁开关培养箱引起的振动或者培养瓶中培养液过少，培养箱搁板表面不平整，这些因素会导致细胞生长不均匀。
细胞抱团怎么处理
一些悬浮细胞抱团生长是正常现象，大部分悬浮细胞在细胞密度很高的情况下，很可能会出现部分细胞抱团生长的现象，聚团细胞很容易死亡并演化成絮状物，殃及周围的悬浮细胞，因此在培养悬浮细胞时需控制好细胞密度。如果出现了细胞团，可以通过细胞筛去掉部分较大的细胞团，也可以尝试一下方法：将细胞悬液收集到15 ml离心管中，静置20 min左右，小心取上层细胞上清培养(该方法只能去除部分较大的细胞团)。
细胞内有空泡，是否是正常现象
部分细胞本身存在一定的空泡(如HepG2，Ishikawa及一些耐药株等)，这个是正常现象。如果只有少数细胞有内出现极少空泡，则很可能是细胞状态不佳，可以通过调整血清浓度，控制消化，控制传代比例及时间等方法来调整细胞状态;如果大部分细胞出现空泡，且单个细胞内空泡数目偏多，则可能细胞代次较高，细胞老化所致，需更换代次较早的细胞。
细胞传两代后开始逐渐死亡的原因
很可能是培养体系不适合细胞(未使用推荐的培养体系)；或者消化过度，对细胞有严重影响；或者是传代比例不合适(具有密度依赖性的细胞，传代太稀；或者生长较快的细胞，传代较密，细胞严重堆叠生长)。
如何区分活细胞和死细胞
显微镜下观察：活细胞中间透亮，饱满，有光泽，死细胞较暗。也可以通过台盼蓝染色来计算细胞活力。
何用台盼兰计数活细胞
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000 个/毫升，在0.1 毫升的细胞悬液中加入0.1 毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞，注意计数需在加入台盼蓝10min内完成。有细胞计数仪的，可直接用计数仪进行
何时须更换培养基
视细胞生长密度而定，常规细胞2天更换培养基。
细胞何时进行传代较好
一般情况下细胞生长至完全汇合后就应该传代，所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密(也就是常说的长老了)，但有接触抑制的细胞，在汇合前就必须进行传代，这类细胞一般在密度70-80%就进行传代，否则会引起细胞分化。
贴壁细胞总有部分圆形还会有一些漂浮的是正常吗
大部分贴壁细胞培养时都会有一些圆形透亮的细胞存在，也会有一些圆形细胞脱落悬浮的情况存在，这种主要是一些新增殖的细胞或由于局部空间不足被挤出的细胞，只要细胞持续增殖，都会有一些圆形细胞或脱落漂浮细胞，不影响细胞整体增殖和实验，保持正常换液、传代周期即可。细胞具体情况也可以参考细胞库不同细胞照片比对，大部分贴壁细胞都会有圆形细胞、脱落细胞、细胞内颗粒等情况。
细胞内很亮小泡泡是什么东西
一部分情况下细胞内小亮点是细胞内黑色颗粒或者一些粘附在细胞表面的碎片，这种黑点会在调整显微镜焦距时呈小黑点或者小亮点，容易被误认为细胞内小泡，其实只是细胞内部或表面一些物质折光形成的光学现象。也有些是细胞内部脂滴，例如3T3-L1细胞在部分培养条件下可以明显看到内部脂滴，染色后更加清晰。
部分细胞在培养时确实可能会有空泡，可以参考细胞库照片比对。若细胞突然出现细胞内空泡增多现象，通常是细胞受到压力的表现，原因可能是培养基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌剂、不适当的CO2环境对培养基中碳酸氢钠浓度影响或培养基的营养消耗殆尽。
细胞培养出现小黑点、污染如何防范
可从以下几个方面进行判断： 细胞小黑点如何判断 1、运动性：很多会动的小黑点，只是发生布朗运动的细胞碎片。从运动性上比较，浮躁的细菌活跃的多。 2、培养基的浑浊度：如果在显微镜下无法辨认，那就交给时间吧。细胞培养基对于细菌来说是非常营养的大餐。一旦发生污染，细菌就会大量繁殖。培养基PH值迅速下降，培养基变黄且会变浑浊。通常在12小时内就可以发现，而在48小时内就非常明显。被污染的细胞培养基变黄且浑浊、未被污染的细胞培养基偏红且澄清。 3、接种平板：将怀疑污染物接种在微生物培养平板中，观察菌落形成情况。碎片?细菌?一目了然。
细胞培养形态与ATCC等官网照片有点区别正常吗?
由于每个实验室培养环境、操作方法、培养基及血清品牌批次不同，细胞实际培养形态、状态、生长速度等培养特性均有可能发生改变，甚至显微镜拍摄效果对细胞形态判断都会有有一定影响。因此细胞形态只能作为实验过程中的参考项目，无法作为细胞状态或者类型的判断依据。实际上，细胞在不同细胞库培养的细胞形态都可能存在一定差异。
问：为什么官网的培养条件和我看的文献里细胞培养条件不一样呢？
答：部分细胞是会出现多种培养条件，我们公司优先选择引种来源的培养条件以及建系者所用培养条件，出现差异的原因是不同实验室在保藏过程中更改了细胞的培养条件，为了避免细胞突然更换培养条件后不适应，建议老师使用厂家推荐的培养条件培养。
问：冻存细胞运输与常温细胞运输相比有什么区别？
答：细胞株发货有常温或者冻存两种形式，常温细胞货期一般一周左右，复苏活细胞一个T25瓶发货；冻存细胞有库存的话，一般当天或者隔天可以发货，细胞系冻存细胞担心客户复苏不成功所以赠送了一管，实际发货2管；原代冻存细胞发货1管，冻存细胞发货是10公斤干冰及顺丰运输，所以冻存细胞需额外支付干冰及运输费200元。
问：培养细胞的培养瓶可以重复利用吗？
答：一般不建议重复利用，特别是贴壁不牢固细胞，重复利用会导致吸附性变差，漂浮增多;一个T25瓶建议使用最多不超过3次，其次需要注意无菌操作，避免污染。
问：运输细胞用的培养基可以回收使用吗?
答：不能回收使用的，运输用的培养基(灌液培养基)营养在路上已经消耗得差不多，所以收到细胞之后，培养箱静置4-6h之后，请及时按照说明书细胞培养条件更换新鲜培养液培养。
问：冻存的细胞出现颜色不一致，有的红有的粉，对复苏会有影响吗？
答：这种情况容易在不同冻存批次间出现，与冻存细胞的密度、冻存液配方、温度导致pH变化等有关，偶尔有遇到这种情况，不是绝对性对细胞状态有影响，可以复苏看下。
问：不同引种单位的同一株细胞，RRID都是一样的吗？
答：是的，同一个细胞系只有一个RRID。
1.细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液，细胞未开封，如出现污染状况等，重发
2.细胞免费售后期为一周，一周内细胞培养出现异常及时拍照反馈。超出一周没有任何反馈视为细胞培养正常，后期若出现培养问题不再免费重发
3.申请售后时请提供细胞收货时及反馈售后当天细胞清晰照片及培养信息，若无清晰照片及相应信息，不予免费售后
4.售后仅针对由于细胞自身状态问题导致不可传代的情况，若客户收货一周内已经传代或转移细胞多次，出现死亡或者污染时不予免费售后
5.冻存细胞发货2管，客户先复苏一支，若复苏失败及时联系我方并在我方指导下复苏第二支。若客户未反馈并复苏2管失败，我方将不提供免费售后服务。冻存细胞售后均发复苏培养，若要重发冻存细胞，需补加200元干冰运输费用
6.客户自行冻存细胞一定要注意冻存后复苏一管检查冻存活性，避免冻存死亡导致绝种。我方不对客户冻存细胞死亡负责，客户冻存细胞死亡时不予免费售后
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