天然配体K12打造的CAR-T细胞，对抗CD7阳性T细胞恶性肿瘤

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：K12-ligand-based CAR T cell therapy for CD7-positive T cell malignancies

中文标题：基于K12配体的CAR-T细胞疗法治疗CD7阳性T细胞恶性肿瘤

发表期刊：《Molecular Therapy: Oncology》

影响因子：5.3

作者单位：

Department of Hematology, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 9713 GZ Groningen, the Netherlands

作者信息：

第一作者：

Nienke Visser

Macarena Gonzalez-Corrales(并列第一作者)

通讯作者：

Edwin Bremer

研究背景

复发/难治性T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)和外周T细胞淋巴瘤预后极差，5年总生存率低于20%，急需新型治疗手段。CD7在约95%的T-ALL和约50%的外周T细胞淋巴瘤中高表达，在部分急性髓系白血病(AML)中也表达，因此是CAR-T治疗的有力靶点。然而，CD7在正常T细胞中也表达，导致CAR-T细胞存在“自相残杀”风险。目前临床常用的CD7 CAR-T多采用单链抗体(scFv)作为识别结构域，但scFv易聚集、引发强直信号导致T细胞耗竭。本研究利用CD7的天然配体K12(SECTM1)作为靶向结构域，构建了第三代CAR-T细胞，并与scFvCD7 CAR-T进行头对头比较，评估其抗肿瘤活性及体内外持久性。

研究方法

作者构建了基于K12配体(短、中、长三种胞外段变体)和基于scFvCD7的第三代CAR(含CD8铰链和跨膜区、4-1BB和CD28共刺激域、CD3ζ信号域)，包装为慢病毒。通过CRISPR/Cas9敲除健康供者CD4/CD8阳性T细胞中的CD7基因以避免自相残杀，然后进行CAR转导。使用Jurkat NFAT-luc报告细胞系评估CAR信号激活水平(相对发光单位)。体外实验中，将CAR-T细胞与CD7阳性(Molt-4、CEM、Jurkat、Hut78、Ramos.CD7)和阴性(Ramos.wt、U937)细胞系及原代T-ALL/AML患者样本共培养48小时，通过Annexin V/PI染色检测细胞毒性，ELISA检测IFN-γ分泌，并通过反复肿瘤再挑战实验(共6轮)评估CAR-T细胞持久性。体内实验采用NSG小鼠尾静脉注射Jurkat-luciferase细胞(2×10⁶/只)，7天后静脉给予K12 CAR-T、CD19 CAR-T或对照，通过生物发光成像监测肿瘤负荷，流式检测外周血、骨髓、脾脏、肝脏中的人CD45/CD3/CD7表达，并记录生存曲线。

实验结果

图 1：CD7阳性肿瘤细胞对K12 CAR的激活作用强于scFvCD7 CAR

作者首先检测了多种细胞系的CD7表达水平，从阴性(Ramos.wt、U937)到内源性阳性(Hut78、Molt-4、Jurkat、CEM)再到高表达(Ramos.CD7)(图1A)。为优化K12 CAR的结构，设计了短、中、长三种不同胞外段长度的CAR(图1B)。将不同CAR转导至Jurkat NFAT-luc报告细胞后，与CD7阳性细胞(CEM和Molt-4)共培养24小时，短、中、长三种K12 CAR均能显著诱导荧光素酶活性，其中短亚型效果最强(图1C)。与多种CD7阳性细胞共培养时，K12 CAR(短亚型)诱导的发光强度最高，且与靶细胞CD7表达水平呈正相关(图1D-F)。进一步直接比较K12短亚型CAR与scFvCD7 CAR(图1G)，结果显示K12 CAR刺激后产生的相对发光单位显著高于scFvCD7 CAR(图1H)，表明K12 CAR的信号激活能力更强。

图 2：K12 CAR-T细胞在体外选择性清除CD7阳性细胞并分泌更高水平的IFN-γ作者在CD7敲除的T细胞中成功表达了K12 CAR和scFvCD7 CAR(转导效率>90%)

在48小时细胞毒性实验中，K12 CAR-T细胞对CD7阳性细胞系(Molt-4、CEM、Jurkat、Ramos.CD7)的杀伤效果与scFvCD7 CAR-T相当，但对CD7阴性细胞(Ramos.wt、U937)无杀伤(图2A-D)。然而，在CD7包被磁珠刺激下，K12 CAR-T细胞分泌的IFN-γ水平显著高于scFvCD7 CAR-T(图2E)。与多种CD7阳性细胞系共培养时，K12 CAR-T产生的IFN-γ也更高(图2F)。此外，K12 CAR-T在反复肿瘤再挑战(共6轮)中保持了持久的杀伤活性，而scFvCD7 CAR-T的活性逐渐下降(图2G-H)。这些结果表明，尽管短期杀伤效果相似，但K12 CAR-T在激活强度、细胞因子分泌和持久性方面优于scFvCD7 CAR-T。

图 3：K12 CAR-T细胞有效清除原代T-ALL和AML患者来源的CD7阳性细胞

作者使用T-ALL和AML患者的原代样本(外周血或骨髓)进行验证。流式检测显示，T-ALL患者样本中CD7阳性率很高(平均>90%)，AML样本中CD7阳性率在50%-98%之间(图3A)。将K12 CAR-T与T-ALL患者来源的原始细胞共培养48小时后，K12 CAR-T诱导的细胞死亡百分比显著高于CD19 CAR-T对照组(图3C)，并且残留的T-ALL细胞计数显著减少(图3D)。K12 CAR-T分泌的IFN-γ水平也远高于对照组(图3E)。在AML患者样本中，K12 CAR-T同样能有效杀伤CD7阳性原始细胞(图3F-G)，流式图显示CD7阳性原始细胞被选择性清除，而残留的活细胞多为CD7阴性(图3H)。这表明K12 CAR-T对患者来源的CD7阳性白血病细胞具有特异性的抗肿瘤活性。

图 4：K12 CAR-T细胞在Jurkat白血病异种移植小鼠模型中显著清除肿瘤并延长生存

作者建立了尾静脉注射Jurkat-luciferase细胞的NSG小鼠模型(图4A)。生物发光成像显示，对照组和CD19 CAR-T治疗组小鼠在第12天已出现明显肿瘤负荷，而K12 CAR-T治疗组小鼠未见明显发光信号(图4B-C)。外周血流式检测表明，K12 CAR-T组小鼠血液中几乎检测不到CD7阳性Jurkat细胞，而对照组有大量肿瘤细胞(图4D-E)。K12 CAR-T治疗显著延长了小鼠生存期，中位生存期>42天，其中5只小鼠中有3只在实验终点(42天)仍无疾病迹象;而对照组和CD19 CAR-T组的中位生存期分别为29天和31天(图4F)。处死后检测骨髓、脾脏和肝脏，K12 CAR-T组5只小鼠中有4只未检测到Jurkat细胞(CD7阳性)，仅1只骨髓中有约8%残留;而对照组骨髓中肿瘤细胞达95%，脾脏明显肿大。K12 CAR-T和CD19 CAR-T在第20天外周血中均占约20%(图4H)。总体而言，K12 CAR-T在体内具有显著的抗白血病活性。

研究结论

本研究系统比较了基于天然配体K12和基于单链抗体scFv的第三代CD7靶向CAR-T细胞。作者发现，K12 CAR-T细胞在CD7特异性激活下产生更高水平的IFN-γ和更强的NFAT信号，且在反复肿瘤再挑战中表现出更持久的细胞毒活性。在体外，K12 CAR-T选择性地清除CD7阳性细胞系及原代T-ALL和AML患者原始细胞;在Jurkat白血病异种移植小鼠模型中，K12 CAR-T治疗使60%(3/5)的小鼠达到无病生存，显著优于对照组。尽管短期杀伤效果与scFvCD7 CAR-T相似，但K12 CAR-T在激活强度、细胞因子分泌和体内持久性方面更具优势，这可能与其天然配体的中等亲和力有关(避免强直信号和耗竭)。因此，K12配体为基础的CAR-T是scFv CAR-T的有效替代方案，值得在复发/难治性CD7阳性T细胞白血病/淋巴瘤及AML中进一步临床转化。