hESC(H1)人胚胎干细胞（STR鉴定报告）

货号：IM-H522

规格：1x10⁶cells/T25或1mL冻存管

形态：球形克隆，贴壁生长

培养基：H1人胚胎干细胞完全培养基

传代比例：1:2至1:3，每周 2-3次

价格：¥5000

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背景介绍培养操作冻存步骤售后服务

背景简介

hESC(H1)细胞株来源于健康男性内细胞团，贴壁生长，呈克隆状，可在hESC/iPSC完全培养基中快速增殖，而边缘分化的细胞则在该培养基中生长较慢，从而选择性扩增并获得高纯度人多能干细胞。包装规格为1mL冻存管，含量为>1x106个/mL，且支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。

一、细胞基本属性
细胞名称	hESC（H1）人胚胎干细胞（STR鉴定报告）
细胞别称	H1; 人胚胎干细胞; WA01
种属来源	人/男性
组织年龄	内细胞团
生长特性	贴壁生长
细胞形态	球形克隆
细胞代数	10代以内
STR鉴定	Amelogenim：X Y；D5S818：9，11；D13S317：8,11；D7S820：8，12；D16S539：9，13；vWA：15，17；THO1：9.3，13；TPOX：8，18；CSF1PO：12，13

细胞荧光检测	人胚胎干细胞 H1（ESC H1）培养鉴定实验报告下载
细胞规格	1×10⁶cells/T25培养瓶或者1mL冻存管包装
支原体检测	无
培养基	H1人胚胎干细胞完全培养基
冻存条件	无血清冻存液，液氮储存
细胞货期	现货，1周左右
发货方式	复苏发货（免运输费用）/ 冻存发货（需加干冰运输费用）顺丰快递
供应限制	仅限于科学研究，绝不可作为动物或人类疾病的治疗产品使用
特别说明	以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主
二、细胞培养操作
试剂准备		1）hESC/iPSC完全培养基配制（500 mL） 1.在4℃条件下解冻hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。 2. 参考表1在生物安全柜中，使用无菌移液管混匀下列成分配制成hESC/iPSC完全培养基，之后置于4℃储存，封口膜封好后2周内使用。 3. 有初培养需扩建的需求，建议先配置100 mL,保证2周内使用完毕。 2）Matrigel铺板（以货号为354277的Corning® Matrigel®包被6孔板为例） A. 分装 Matrigel 1.货号354277的Matrigel，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推荐Dilution Factor为278 μL，则表明278 μL可包被4块6孔板，分装数量=5 mL /0.278=17.98。 2. 准备18个无菌1.5 mL EP管，标记Matrigel日期、操作人；1mL无菌吸头；EP管架，均置于-20℃冰箱中预冷1小时。 3. 将Matrigel放置4℃冰箱过夜解冻，当Matrigel完全解冻即可开始分装。注：在解冻时，将Matrigel放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。 4.准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。 5.混匀Matrigel，无菌分装于各个1.5 mL EP管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。 6. 将分装后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。 B.铺板 1.取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL离心管中，准备4个6孔板，标记Matrigel、批号、日期和操作人。 2.1 mL无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的Matrigel（5mL）置于4℃冰箱解冻至完全化冻。 3.准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1mL吸头放置于生物安全柜上。 4.用预冷吸头向解冻过的Matrigel（5mL）加入1 mL冷的DMEM/F12并反复吹打解冻混匀。 5.吸出已解冻混匀的Matrigel加入离心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反复吹打混匀。 6.分装1.5 mL/孔于4个六孔板中，轻轻摇晃混匀。 7. 培养板置于室温1小时后即可使用，或置于4℃冷藏过夜，两周内使用。
复苏方法		1）复苏hESC/iPSC（以6孔板为例） 1. 将水浴锅预热至37℃；并将Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（15~30℃）。 2. 取4 mL hESC/iPSC完全培养基，按照1:4000比例加入1 μL的hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（15~30℃）。注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。 3. 取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。 4. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入10mL DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。 5. 吸弃上清，加入预温的4 mL的hESC/iPSC完全培养基+hESC/iPSC Supplement C制备细胞悬液，尽量避免吹打。注：可留20 μL上清液，轻弹管底，使细胞悬浮液更均匀，避免成较大细胞团。 6. 吸除6孔板中2孔的Matrigel包被液，将细胞悬液按照2 mL/孔接种到1个孔中。 7. 水平十字摇匀三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。 8. 18-24小时后换新的hESC/iPSC完全培养基，之后每天更换培养基。注：在hESC(H1)培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4mL/孔。
传代方法		传代hESC/iPSC（以6孔板为例） 1. 传代条件：① 细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示），一般情况下每3-4天传代； ② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。 2.传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀（如图1(C-D)所示），建议按照1:8进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。注：1:8传代就是1个孔瓶传8个孔（以6孔板为例）。 3. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（~25℃）。 4. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的hESC/iPSC完全培养基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（~25℃）。 5. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（~25℃）。 6. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的hESC/iPSC完全培养基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（~25℃）。 7. 将孔内培养基吸取，加入2 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃并吸取。 8. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆盖孔底。 9. 置于37℃培养箱中孵育8-9 min。注：① 消化8-9 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间； ② 保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。 10. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。 11. 及时加入2 mL/孔预温的hESC/iPSC完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质。注：① 加hESC/iPSC完全培养基 + hESC/iPSC Supplement C时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免反复吹打；有部分细胞（10%～15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间（< 10min）。 ②hESC(H1)细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过4孔（六孔板）。 12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入预温的hESC/iPSC完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。 13. 在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤9获得的细胞悬液收集至2mL离心管，轻柔颠倒混匀细胞1-2次；再按照传代比例接种。 14. 接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。 15. 18-24小时后更换新hESC/iPSC完全培养基，此后每天换液，4-5天后继续传代/冻存。
注意事项		1.运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 2.因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现象。	1.收货时若发现干冰化完，检查冻存管是否融化，若已融化需直接离心细胞接种观察，若未融化可以将细胞按正常步骤保存； 2.为保证细胞的高存活率，收到产品后，请立即解冻复苏细胞。
到货须知	1.收到细胞后，及时拍照记录有无漏液、浑浊或瓶身破损现象。 2.静置完成后，取出细胞培养瓶，镜检、拍照（当天以及第 2,3 天请拍照），记录细胞状态 (所拍照片将作为后续服务依据)；建议细胞传代培养后，定期拍照、记录细胞生长状态。 3.由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。 4. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。
备注：客户在细胞培养过程中，有任何技术问题可以拨打技术服务电话：400-080-3389 按 2，我们随时给予解答。
三、细胞冻存操作
冻存液配方	无血清冻存液，液氮储存
细胞密度	待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例
冻存方法	3）冻存hESC/iPSC（以6孔板为例） 1. 当细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示）可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。 2. 准备相应数量的1.5/2 mL冻存管，标记细胞名称、代次（P#）、日期、操作人。 3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室温预温，使用前注意摇匀。 4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃数次，再吸取。 5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于37℃培养箱中，计时8-9 min（可参考“六、传代hESC/iPSC”步骤）。 6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。 7. 摇匀预温的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL冻存液，轻柔吹打，水平十字摇匀3次，随后吸取细胞悬液加入1.5/2 mL冻存管中。 8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。
注意事项	冻存细胞转入液氮后及时复苏一管检查细胞冻存活性，若有异常，及时调整实验方案